تعريف العصبية المستندة إلى شبكة الاتصال من بويضات شجيرة الماوس تنمويا المختصة أو غير كفء
Summary
نقدم هنا، على بروتوكول لتقييم غير الغازية لاختصاص البويضيه التنموية التي يتم إجراؤها أثناء بهم في المختبر النضج من حويصلة جيرمنال إلى المرحلة الثانية الطورية. يجمع هذا الأسلوب بين الوقت الفاصل بين التصوير الجسيمات الصورة فيلوسيميتري (PIV) وتحليل الشبكات العصبية.
Abstract
عيادات العقم ستستفيد من القدرة على تحديد تنمويا المختصة مقابل بويضات غير كفء باستخدام إجراءات غير الغازية، وبالتالي تحسين نتائج الحمل الشاملة. ونحن مؤخرا بوضع طريقة تصنيف استناداً إلى الملاحظات حية مجهرية من بويضات الماوس أثناء بهم في المختبر النضج من حويصلة جيرمنال (GV) إلى المرحلة الثانية الطورية، يليها تحليل تحركات هيولى وتحدث خلال هذه الفترة الزمني الفاصل. نقدم هنا، بروتوكولات مفصلة من هذا الإجراء. بويضات معزولة عن المسام antral شجيرة ومثقف ح 15 داخل مجهر مجهزة لتحليل الوقت الفاصل بين شركة 37 درجة مئوية و 5%2. التقاط الصور في فواصل زمنية 8 دقيقة. ويتم تحليل الصور باستخدام الأسلوب فيلوسيميتري صورة الجسيمات (PIV) يحسب لكل البويضات، التشكيل الجانبي من “هيولى حركة السرعات” (متجهات) التي تحدث طوال فترة الثقافة. وأخيراً، يتم تغذية متجهات البويضات كل واحد من خلال أداة تصنيف رياضي (شبكات عصبونية اصطناعية تغذية إلى الأمام، والفن) التي تتوقع احتمال مشيج تنمويا مختصة أو غير مختصة بدقة 91.03%. يمكن اختبار هذا البروتوكول، تم إعدادها للماوس، الآن على بويضات أنواع الأخرى، بما فيها البشر.
Introduction
العقم الإناث هو أمراض التي تؤثر على عدد متزايد من النساء. ووفقا “منظمة الصحة العالمية”، حوالي 20% أزواج المصابين بالعقم، مع 40% بسبب العقم الإناث. وبالإضافة إلى ذلك، أكثر من ثلث النساء تمر علاجات السرطان (300,000 في السنة والسنة 30,000 في الولايات المتحدة الأمريكية أو إيطاليا، على التوالي) وضع سابق لأوانه فشل المبيض.
استراتيجية لمنع العقم لدى مرضى السرطان هو عزلة ونعد جريبات المبيض قبل علاج الأورام، تليها في المختبر النضج (ناقلات) من بويضات غف إلى مرحلة صناعة المعلومات (مرحلة انتقالية غف للوزارة). أن تحسين توافر علامات غير الغازية الكفاءة الإنمائية البويضيه التسميد والعمليات الإنمائية ونجاح الحمل الشاملة1،2.
استناداً إلى التكوين الخاص بها الكروماتين ولاحظ بعد تلطيخ مع فلوروتشرومي سوبرافيتال هويشت 33342، بويضات الثدييات شجيرة تصنف أما محاطة نوية (SN) أو لا تحيط نوية (تسويق)3. بالإضافة إلى منظمتهم الكروماتين مختلفة، عرض هذين النوعين من بويضات العديد من الاختلافات المورفولوجية والوظيفية3،،من45،،من67،8 ،9، بما في ذلك اختصاصها هو والإنمائية. عندما عزل من المبيض ونضجت في المختبر، كل نوع من بويضات الوصول إلى مرحلة صناعة المعلومات، وبعد التلقيح الحيوانات المنوية، تطوير إلى مرحلة 2-الخلية، ولكن فقط تلك مع منظمة الكروماتين SN قد وضع لمدة9. على الرغم من أن جيدة كطريقة تصنيف لاختيار المختصة مقابل بويضات غير كفء، العيب الرئيسي هو تأثير مطفرة فلوروتشرومي نفسها، وقبل كل شيء، الأشعة فوق البنفسجية المستخدمة للكشف عنها قد يكون على الخلايا.
ولجميع هذه الأسباب، بحثنا عن علامات أخرى غير الغازية المرتبطة بتكيف الكروماتين التعطيل أو تسويق التي يمكنها أن تحل محل استخدام هويشت مع المحافظة على دقة عالية التصنيف نفسه. ملاحظة الوقت الفاصل بين “سرعات الحركة هيولى” (متجهات) تبرز كسمة مميزة لحالة خلية. على سبيل المثال، أظهرت الدراسات الأخيرة سجلت الرابطة بين متجهات وقت الإخصاب وقدرة الماوس و zygotes البشري الجيني الكامل والتنمية الكاملة ومدتها10،11.
وبناء على هذه الدراسات السابقة، يصف لنا هنا منبرا للاعتراف بالماوس تنمويا المختصة أو غير كفء بويضات شجيرة5،6،،من78. يقوم المنهاج على ثلاث خطوات رئيسية: 1) تصنف بويضات معزولة عن المسام antral أولاً استناداً إلى تكوين الكروماتين أما نوية محاطة (SN) أو نوية يحيط عدم (تسويق)؛ 2) تؤخذ صور الوقت الفاصل بين متجهات التي تحدث أثناء فترة الانتقال غف للوزارة لكل واحدة من البويضات وتحليلها مع الجسيمات الصورة فيلوسيميتري (PIV)؛ و 3) يتم تحليل البيانات التي تم الحصول عليها مع PIV مع تغذية إلى الأمام مصطنعة العصبية شبكة (الفن) لتصنيف أعمى12،13. يمكننا إعطاء تفاصيل عن الخطوات الأكثر أهمية من الإجراءات المصممة للماوس لجعلها جاهزة متوفرة يمكن اختبارها واستخدامها لأنواع الثدييات الأخرى (مثل الأبقار، والقرد والبشر).
Protocol
Representative Results
Discussion
وهناك عدة خطوات حاسمة واحدة يجب العناية أثناء تنفيذ هذا البروتوكول مع بويضات الماوس وكذلك مع تلك الأنواع الأخرى. مرة واحدة معزولة عن تلك المسام، بويضات ينبغي نقلها فورا إلى قطرات التسجيل، كما الفصل من الركام رفيق الخلايا المشغلات بداية الانتقال غف لوزارة صناعة المعلومات. إمكانية إدخال ت?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقدم هذا العمل ممكناً بفضل دعم من: جامعة بافيا الغواتيمالية عام 2016؛ جامعة بارما سن الفيل عام 2014، عام 2016؛ و Kinesis لتوفير بلاستيكواري اللازمة للاضطلاع بهذه الدراسة. ونحن نشكر الدكتور شين وندسور (كلية الهندسة، جامعة بريستول، المملكة المتحدة) لتوفير البرمجيات Cell_PIV.
Materials
| Folligon | Intervet | A201A02 | Hormonal treatment |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | For oocyte heterochromatin staining |
| Cell culture Petri-dish 35 mm x 10 mm | Corning | 430165 | For COCs isolation |
| EmbryoMax M2 Medium (1X), Liquid, with phenol red | Merck-Millipore | MR-015-D | For COCs isolation |
| MEM Alpha medium (1X) + Glutamax | Sigma-Aldrich | M4526 | For oocyte in vitro maturation |
| Cell culture Petri-dish 35 mm glass-bottom | WillCo | GWSt-3522 | For imaging experiments |
| BioStation IM-LM | Nikon | MFA91001 | Live cell screening system |
| Pasteur pipette | Delchimica Scientific Glassware | 6709230 | For follicles manipulation |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | To prevent contamination and medium evaporation |
| Penicillin / Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | To prevent medium contamination |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | ML16141079 | For making up αMEM medium |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030 | For making up αMEM medium |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | For making up αMEM medium |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3310 | For making up αMEM media |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P4562 | For making up αMEM media |
| Zoletil (Tiletamina and Zolazepan cloridrate) | Virbac Srl | QN01AX9 | For mice anesthesia |
| Cell_PIV sofware | Kindly provided by Dr. Shane Windsor, University of Bristol, UK | - | - |
| MATLAB | The MathWorks, Natick, MA | - | For multi-paradigm numerical computing |
References
- Patrizio, P., Fragouli, E., Bianchi, V., Borini, A., Wells, D. Molecular methods for selection of the ideal oocyte. Reprod. Biomed. Online. 15 (3), 346-353 (2007).
- Rienzi, L., Vajta, G., Ubaldi, F. Predictive value of oocyte morphology in human IVF: a systematic review of the literature. Human. Reprod. Update. 17 (1), 34-35 (2011).
- Tan, J. H., et al. Chromatin configurations in the germinal vesicle of mammalian oocytes. Mol. Hum. Reprod. 15 (1), 1-9 (2009).
- Vigone, G., et al. Transcriptome based identification of mouse cumulus cell markers that predict the developmental competence of their enclosed antral oocytes. BMC Genomics. 14, 380 (2013).
- Bui, T. T., et al. Cytoplasmic movement profiles of mouse surrounding nucleolus and not-surrounding nucleolus antral oocytes during meiotic resumption. Mol. Reprod. Dev. 84 (5), 356-362 (2017).
- Zuccotti, M., Piccinelli, A., Giorgi Rossi, P., Garagna, S., Redi, C. A. Chromatin organization during mouse oocyte growth. Mol. Reprod. Dev. 41 (4), 479-485 (1995).
- Zuccotti, M., Garagna, S., Merico, V., Monti, M., Redi, C. A. Chromatin organisation and nuclear architecture in growing mouse oocytes. Mol. Cell. Endocrinol. 234 (1-2), 11-17 (2005).
- Zuccotti, M., Merico, V., Cecconi, S., Redi, C. A., Garagna, S. What does it take to make a developmentally competent mammalian egg?. Hum. Reprod. Update. 17 (4), 525-540 (2011).
- Inoue, A., Nakajima, R., Nagata, M., Aoki, F. Contribution of the oocyte nucleus and cytoplasm to the determination of meiotic and developmental competence in mice. Hum. Reprod. 23 (6), 1377-1384 (2008).
- Ajduk, A., et al. Rhythmic actomyosin-driven contractions induced by sperm entry predict mammalian embryo viability. Nat. Commun. 2, 417 (2011).
- Swann, K., et al. Phospholipase C-ζ-induced Ca2+ oscillations cause coincident cytoplasmic movements in human oocytes that failed to fertilize after intracytoplasmic sperm injection. Fertil. Steril. 97 (3), 742-747 (2012).
- Thakur, A., Mishra, V., Jain, S. K. Feed forward artificial neural network: tool for early detection of ovarian cancer. Sci. Pharm. 79 (3), 493-505 (2011).
- Laudani, A., Lozito, G. M., Riganti Fulginei, F., Salvini, A. On Training Efficiency and Computational Costs of a Feed Forward Neural Network: A Review. Comput. Intell. Neurosci. 2015, 818243 (2015).
