מזהה מבוססי-רשת עצבית של Oocytes וחוה עכבר נכה כשיר או לא מוכשר
Summary
כאן, אנו מציגים עבור הערכה בלתי פולשני של מיומנות התפתחותית oocyte שבוצעה במהלך שלהם במבחנה ההבשלה של שלפוחית germinal לשלב השני מפה של פרוטוקול. שיטה זו משלבת הדמיה בצילום מואץ עם חלקיקים תמונה velocimetry (PIV) וניתוחים רשת עצבית.
Abstract
מרפאות פוריות ירוויחו היכולת לבחור כשיר מבחינת לעומת oocytes כשירים באמצעות הליכים פולשנית, ובכך לשפר את התוצאה הכוללת של ההריון. לאחרונה פיתחנו שיטת סיווג המבוסס על תצפיות חיים מיקרוסקופיים של העכבר oocytes במהלך שלהם במבחנה ההבשלה של שלפוחית germinal (GV) ועד השלב השני מפה של, ואחריו הניתוח של התנועות cytoplasmic המתרחשים במהלך תקופה זו זמן לשגות. כאן, אנו מציגים נתונים היסטוריים הפרוטוקולים של הליך זה. Oocytes מבודד זקיקים antral וחוה, תרבותי עבור h 15 בתוך מיקרוסקופ מצויד לניתוח זמן לשגות-CO 37 ° C ו-5%2. תמונות נלקחים במרווחים של 8 דקות. התמונות ניתוח בשיטת Velocimetry תמונת החלקיקים (PIV) מחשבת, עבור כל oocyte, הפרופיל של מהירויות התנועה Cytoplasmic (CMVs) המתרחשים לאורך כל תקופת תרבות. בסופו של דבר, CMVs של כל יחיד oocyte מוזנים דרך סיווג מתמטית כלי (רשת עצבית מלאכותית הזנה-קדימה, FANN), אשר מנבאת את ההסתברות של תא רבייה להיות נכה או לא מוכשר עם דיוק של 91.03%. פרוטוקול זה, להגדיר עבור העכבר, עכשיו נבדק על oocytes של מינים אחרים, כולל בני אדם.
Introduction
פוריות נשית היא מחלה המשפיעה על מספר גדל והולך של נשים. בסביבות על פי ארגון הבריאות העולמי, 20% של זוגות הם עקרים, עם 40% עקב בעיות פוריות נשית. בנוסף, שליש אחד של נשים שעברו טיפולים בסרטן (300,000 לשנה ו- 30,000 שנה בארצות הברית או איטליה, בהתאמה) לפתח שחלות מוקדמת.
אסטרטגיה כדי למנוע בעיות פוריות אצל חולי סרטן הוא בידוד הקפאה קריוגנית של זקיקי השחלה לפני הטיפול אונקולוגית, ואחריו במבחנה ההבשלה (IVM) של oocytes GV לבמה MII (GV-כדי-MII המעבר). הזמינות של סמנים לא פולשנית של מיומנות התפתחותית oocyte תשפר ההפריה, תהליכים התפתחותיים, הכוללת הריון הצלחה1,2.
בהתבסס על תצורת כרומטין שלהם נצפתה לאחר צביעת עם fluorochrome supravital Hoechst 33342, יונקים oocytes וחוה מסווגים מוקף גרעינון (SN) או לא מוקף גרעינון (NSN)3. מלבד ארגון כרומטין שונים שלהם, אלו שני סוגים של oocytes להציג הרבה הבדלים מורפולוגיים ופונקציונליים3,4,5,6,7,8 ,9, כולל את היכולות meiotic והפיתוחים שלהם. כאשר מבודד מן השחלה, התבגר במבחנה, הן סוג של oocytes להגיע לשלב MII, ולפתח הזרעה זרע, לשלב 2 תאים, אך רק אלו עם ארגון כרומטין SN עלולים לפתח המונח9. אמנם טוב כשיטה סיווג לבחירת המוסמכת נ’ oocytes לא מוכשר, אולם החיסרון העיקרי הוא ההשפעה של ה מוטגני fluorochrome עצמה ו, ומעל לכל, את האור האולטרה סגול המשמש לצורך זיהוי שלו שאולי על התאים.
מכל הסיבות האלה, חיפשנו סמנים אחרים לא פולשנית המשויך קונפורמציה כרומטין SN או NSN יכול להחליף את השימוש Hoechst תוך שמירה על דיוק גבוהה סיווג אותו. התבוננות בצילום מואץ תנועה Cytoplasmic מהירויות (CMVs) מתגלה כמו תכונה ייחודית של מצב התא. לדוגמה, מחקרים שנעשו לאחרונה הראו שהקשר בין CMVs להקליט בזמן ההפריה והיכולת של האדם מופרות של עכבר preimplantation מלאה, פיתוח מלא לטווח10,11.
בהתבסס על מחקרים אלה קודמות, נתאר כאן פלטפורמה עבור ההכרה של עכבר נכה כשיר או לא מוכשר oocytes לבגרות5,6,7,8. הפלטפורמה מבוססת על שלושה שלבים עיקריים: 1) Oocytes מבודד antral זקיקים מסווגים הראשון המבוסס על כרומטין בתצורה שלהם או של גרעינון מוקף (SN) או של גרעינון מוקף לא (NSN); 2) תמונות בצילום מואץ של CMVs המתרחשים במהלך המעבר GV-כדי-MII של כל יחיד oocyte נלקח וניתח עם חלקיקים תמונה velocimetry (PIV); ו- 3) נתונים שהושגו עם PIV מנותחים עם הזנה-קדימה מלאכותי עצבית רשת (FANN) עבור סיווג עיוור12,13. אנחנו נותנים פרטים על השלבים הקריטיים ביותר של ההליך מיועד העכבר שיהיה מוכן זמין להיות נבדק, המשמש עבור יונקים אחרים (למשל, שור, קופים, בני אדם).
Protocol
Representative Results
Discussion
ישנם מספר שלבים קריטיים אחד אמור לטפל תוך כדי ביצוע פרוטוקול זה עם העכבר oocytes, כמו גם עם אלה של מינים אחרים. ברגע מבודד זקיקים שלהם, oocytes מיד יועברו לתוך הטיפות הקלטה, כמו פרידה תלולית לוויה תאים המפעילים תחילת המעבר GV-כדי-MII. שינוי אפשרי בפרוטוקול הנוכחי יכול להיות התוספת של 3-איזובוטיל-1-methylxa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נעשתה התאפשרה הודות לתמיכה על ידי: אוניברסיטת פאביה FRG 2016; האוניברסיטה של פארמה FIL 2014, 2016; Kinesis לאספקת plasticware את הצורך לבצע את המחקר הזה. אנו מודים ד”ר שיין וינדזור (הפקולטה להנדסה, אוניברסיטת בריסטול, אנגליה) למתן את התוכנה Cell_PIV.
Materials
| Folligon | Intervet | A201A02 | Hormonal treatment |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | For oocyte heterochromatin staining |
| Cell culture Petri-dish 35 mm x 10 mm | Corning | 430165 | For COCs isolation |
| EmbryoMax M2 Medium (1X), Liquid, with phenol red | Merck-Millipore | MR-015-D | For COCs isolation |
| MEM Alpha medium (1X) + Glutamax | Sigma-Aldrich | M4526 | For oocyte in vitro maturation |
| Cell culture Petri-dish 35 mm glass-bottom | WillCo | GWSt-3522 | For imaging experiments |
| BioStation IM-LM | Nikon | MFA91001 | Live cell screening system |
| Pasteur pipette | Delchimica Scientific Glassware | 6709230 | For follicles manipulation |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | To prevent contamination and medium evaporation |
| Penicillin / Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | To prevent medium contamination |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | ML16141079 | For making up αMEM medium |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030 | For making up αMEM medium |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | For making up αMEM medium |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3310 | For making up αMEM media |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P4562 | For making up αMEM media |
| Zoletil (Tiletamina and Zolazepan cloridrate) | Virbac Srl | QN01AX9 | For mice anesthesia |
| Cell_PIV sofware | Kindly provided by Dr. Shane Windsor, University of Bristol, UK | - | - |
| MATLAB | The MathWorks, Natick, MA | - | For multi-paradigm numerical computing |
References
- Patrizio, P., Fragouli, E., Bianchi, V., Borini, A., Wells, D. Molecular methods for selection of the ideal oocyte. Reprod. Biomed. Online. 15 (3), 346-353 (2007).
- Rienzi, L., Vajta, G., Ubaldi, F. Predictive value of oocyte morphology in human IVF: a systematic review of the literature. Human. Reprod. Update. 17 (1), 34-35 (2011).
- Tan, J. H., et al. Chromatin configurations in the germinal vesicle of mammalian oocytes. Mol. Hum. Reprod. 15 (1), 1-9 (2009).
- Vigone, G., et al. Transcriptome based identification of mouse cumulus cell markers that predict the developmental competence of their enclosed antral oocytes. BMC Genomics. 14, 380 (2013).
- Bui, T. T., et al. Cytoplasmic movement profiles of mouse surrounding nucleolus and not-surrounding nucleolus antral oocytes during meiotic resumption. Mol. Reprod. Dev. 84 (5), 356-362 (2017).
- Zuccotti, M., Piccinelli, A., Giorgi Rossi, P., Garagna, S., Redi, C. A. Chromatin organization during mouse oocyte growth. Mol. Reprod. Dev. 41 (4), 479-485 (1995).
- Zuccotti, M., Garagna, S., Merico, V., Monti, M., Redi, C. A. Chromatin organisation and nuclear architecture in growing mouse oocytes. Mol. Cell. Endocrinol. 234 (1-2), 11-17 (2005).
- Zuccotti, M., Merico, V., Cecconi, S., Redi, C. A., Garagna, S. What does it take to make a developmentally competent mammalian egg?. Hum. Reprod. Update. 17 (4), 525-540 (2011).
- Inoue, A., Nakajima, R., Nagata, M., Aoki, F. Contribution of the oocyte nucleus and cytoplasm to the determination of meiotic and developmental competence in mice. Hum. Reprod. 23 (6), 1377-1384 (2008).
- Ajduk, A., et al. Rhythmic actomyosin-driven contractions induced by sperm entry predict mammalian embryo viability. Nat. Commun. 2, 417 (2011).
- Swann, K., et al. Phospholipase C-ζ-induced Ca2+ oscillations cause coincident cytoplasmic movements in human oocytes that failed to fertilize after intracytoplasmic sperm injection. Fertil. Steril. 97 (3), 742-747 (2012).
- Thakur, A., Mishra, V., Jain, S. K. Feed forward artificial neural network: tool for early detection of ovarian cancer. Sci. Pharm. 79 (3), 493-505 (2011).
- Laudani, A., Lozito, G. M., Riganti Fulginei, F., Salvini, A. On Training Efficiency and Computational Costs of a Feed Forward Neural Network: A Review. Comput. Intell. Neurosci. 2015, 818243 (2015).
