Uma identificação baseado em Rede Neural de ovócitos já crescido mentalmente competente ou incompetente do Mouse
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para avaliação não invasiva de competência no desenvolvimento de oócito realizada durante sua em vitro maturação da vesícula germinal à fase de metáfase II. Este método combina imagens de lapso de tempo com análises de rede neural e Velocimetria por imagem (PIV).
Abstract
Clínicas de infertilidade beneficiaria a habilidade de selecionar mentalmente competente vs incompetente oócitos usando procedimentos invasivos, melhorando assim o resultado global da gravidez. Recentemente desenvolvemos um método de classificação baseado em observações ao vivo microscópicas de ovócitos de rato durante sua em vitro maturação da vesícula germinal (GV) à fase metáfase II, seguido da análise dos movimentos citoplasmáticos ocorrem durante este período de lapso de tempo. Aqui, apresentamos protocolos detalhados deste procedimento. Oócitos são isolados de folículos antrais já crescidos e cultivados para 15 h no interior de um microscópio equipado para a análise de lapso de tempo a 37 ° C e 5% de CO2. Fotos são tiradas em intervalos de 8 min. As imagens são analisadas usando o método Particle Image Velocimetry (PIV) que calcula, para cada oócito, o perfil de velocidades de movimento citoplasmático (CMVs) ocorrendo durante todo o período de cultura. Finalmente, os CMVs de cada único oócito são alimentados através de uma ferramenta de classificação matemática (Feed-forward de Rede Neural Artificial, FANN), que prevê a probabilidade de um gameta ser mentalmente competente ou incompetente com uma precisão de 91.03%. Este protocolo, configurar para o mouse, agora poderia ser testado em oócitos de outras espécies, incluindo seres humanos.
Introduction
Infertilidade feminina é uma patologia que afecta um número crescente de mulheres. De acordo com a Organização Mundial de saúde, cerca de 20% dos casais são inférteis, com um 40% devido à infertilidade feminina. Além disso, um terço das mulheres passando por tratamentos contra o cancro (300.000 por ano e 30.000/ano nos EUA e Itália, respectivamente) desenvolver falência ovariana prematura.
Uma estratégia para impedir a infertilidade em pacientes com câncer é o isolamento e criopreservação de folículos nos ovários antes do tratamento oncológico, seguido em vitro maturação (IVM) de ovócitos GV à fase MII (transição de GV-para-MII). A disponibilidade de marcadores não-invasivo de competência no desenvolvimento de oócito melhoraria a fertilização e processos de desenvolvimento e o global gravidez sucesso1,2.
Com base na sua configuração de cromatina observada após coloração com o fluorocromo supravital Hoechst 33342, oócitos já crescidos mamíferos classificam-se como um nucléolo rodeado (SN) ou um não cercado nucléolo (NSN)3. Além de sua organização da cromatina diferentes, estes dois tipos de oócitos exibir muitas diferenças morfológicas e funcionais3,4,5,6,7,8 ,9, incluindo sua competência meiótica e do desenvolvimento. Quando isolado do ovário e amadurecido em vitro, ambos tipo de oócitos alcance o estágio MII e após a inseminação de espermatozoides, desenvolvem-se para a fase 2-célula, mas apenas aqueles com uma organização da cromatina SN podem desenvolver a termo9. Embora bom como um método de classificação para selecionar competente vs incompetente oócitos, a principal desvantagem é o efeito mutagénico que o fluorocromo em si e, acima de tudo, a luz UV usado para sua detecção podem ter sobre as células.
Por todas estas razões, nós procuramos por outros marcadores não invasivos associados a conformação da cromatina SN ou NSN que poderia substituir o uso de Hoechst, mantendo a mesma precisão de alta classificação. A observação do tempo-lapso de velocidades de movimento citoplasmático (CMVs) está emergindo como uma característica distintiva do status do celular. Por exemplo, estudos recentes demonstraram que a associação entre CMVs gravado no momento da fertilização e da capacidade de zigotos humanos e rato pré-implantacional completa e desenvolvimento termo10,11.
Baseado nestes estudos anteriores, descrevemos aqui uma plataforma para o reconhecimento de rato mentalmente competente ou incompetente oócitos já crescido5,6,7,8. A plataforma é baseada em três etapas principais: 1) oócitos isolados de folículos antrais primeiro são classificados com base na sua configuração de cromatina ou como um nucléolo rodeado (SN) ou um nucléolo não-cercado (NSN); 2) Time-Lapse imagens de CMVs ocorrendo durante a transição de GV-para-MII de cada único oócito são tomadas e analisadas com Velocimetria por imagem (PIV); e 3) os dados obtidos com PIV são analisados com um Feed-forward Artificial Neural Network (FANN) para classificação cego12,13. Nós dar detalhes das etapas mais críticas do processo projetado para o mouse para torná-lo pronto para ser testado e usado para outras espécies de mamíferos (por exemplo, bovinos, macacos e humanos).
Protocol
Representative Results
Discussion
Existem várias etapas críticas um deve cuidar da durante a execução do presente protocolo com oócitos de rato, bem como com os de outras espécies. Uma vez isolados de seus folículos, oócitos devem ser imediatamente transferidos para as gotas de gravação, como a separação do cumulus companheiro células disparadores o início da transição GV-para-MII. Uma eventual modificação do presente protocolo pode ser a adição de 3-isobutil-1-methylxanthine (IBMX) para o meio de M2 utilizado para isolamento de COCs….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho tornou-se possível graças ao apoio por: Universidade de Pavia FRG 2016; Universidade de Parma FIL 2014, 2016; e Kinesis para fornecer o plasticware necessária para realizar este estudo. Agradecemos o Dr. Shane Windsor (Faculdade de engenharia, Universidade de Bristol, Reino Unido) para fornecer o software Cell_PIV.
Materials
| Folligon | Intervet | A201A02 | Hormonal treatment |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | For oocyte heterochromatin staining |
| Cell culture Petri-dish 35 mm x 10 mm | Corning | 430165 | For COCs isolation |
| EmbryoMax M2 Medium (1X), Liquid, with phenol red | Merck-Millipore | MR-015-D | For COCs isolation |
| MEM Alpha medium (1X) + Glutamax | Sigma-Aldrich | M4526 | For oocyte in vitro maturation |
| Cell culture Petri-dish 35 mm glass-bottom | WillCo | GWSt-3522 | For imaging experiments |
| BioStation IM-LM | Nikon | MFA91001 | Live cell screening system |
| Pasteur pipette | Delchimica Scientific Glassware | 6709230 | For follicles manipulation |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | To prevent contamination and medium evaporation |
| Penicillin / Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | To prevent medium contamination |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | ML16141079 | For making up αMEM medium |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030 | For making up αMEM medium |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | For making up αMEM medium |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3310 | For making up αMEM media |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P4562 | For making up αMEM media |
| Zoletil (Tiletamina and Zolazepan cloridrate) | Virbac Srl | QN01AX9 | For mice anesthesia |
| Cell_PIV sofware | Kindly provided by Dr. Shane Windsor, University of Bristol, UK | - | - |
| MATLAB | The MathWorks, Natick, MA | - | For multi-paradigm numerical computing |
References
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