Нейронной сети идентификация развивающих компетентным или некомпетентных мыши взрослой яйцеклеток
Summary
Здесь мы представляем протокол для неинвазивной оценки развития компетенции ооцитов осуществляется во время их в vitro созревания от Жерминаль везикул на стадии метафазы II. Этот метод сочетает в себе покадровой изображений с Велосиметрия изображение частиц (PIV) и нейросетевого анализа.
Abstract
Бесплодие клиники выиграют от возможность выбора развивающих компетентным против некомпетентных яйцеклеток с помощью неинвазивных процедур, тем самым повышая общий исход беременности. Мы недавно разработали классификацию метод, основанный на микроскопические прямом наблюдений ооцитов мыши во время их в vitro созревания из везикул Жерминаль (GV) до метафазы II стадии, затем анализ движения цитоплазмы происходящие в этот промежуток времени период. Здесь мы представляем подробные протоколы этой процедуры. Ооциты изолированы от взрослой полостная фолликулов и культивировали для 15 h внутри микроскопом, оборудованных для покадровой анализа при 37 ° C и 5% CO2. Снимки делаются в интервалах 8 мин. Изображения, анализируются с помощью метода Велосиметрия изображение частиц (PIV), который вычисляет для каждой ооцитов, профиль цитоплазматических скоростей движения (мезошкала), происходящие на протяжении всего периода культуры. Наконец мезошкала каждого одной яйцеклетки подаются через инструмент математических классификации (Feed вперед искусственные нейронные сети, ФЭНН), который предсказывает вероятность гамет развивающих компетентным или некомпетентных с точностью 91.03%. Этот протокол, для мыши, теперь может быть проверена на ооциты других видов, включая человека.
Introduction
Женское бесплодие является патологией, которая затрагивает все большее число женщин. По данным Всемирной организации здравоохранения около 20% супружеских пар являются бесплодными, с 40% за счет женского бесплодия. Кроме того, одна треть женщин, проходящих лечение рака (300 000 в год и 30 000 человек в год в США или Италии, соответственно) разработать преждевременное угасание функции яичников.
Стратегия по предотвращению бесплодия у больных раком является изоляции и криоконсервацию фолликулы до лечения онкологических заболеваний, следуют в vitro созревания (IVM) GV яйцеклеток до стадии MII (GV-MII переход). Наличие Неинвазивные маркеры ооцитов развития компетенции позволит улучшить оплодотворение и процессов развития и общей беременность успех1,2.
На основе конфигурации их хроматина, наблюдается после окрашивания с supravital флюрохром Hoechst 33342, млекопитающих взрослой ооциты классифицируются либо как окружили ядрышко (SN) или не окружили ядрышко (NSN)3. Помимо их организации различных хроматина эти два типа ооциты отображения многих Морфологические и функциональные различия3,4,5,6,7,8 ,9, включая их meiotic и развития компетенции. Когда изолированный от яичника и созрела в пробирке, оба типа ооциты достигают стадии MII и после осеменения спермы, разработки к стадии 2-клеток, но только те, с Организацией хроматина SN может развиться в срок9. Хотя хорошо, как метод классификации для выбора компетентного против некомпетентных ооцитов, главным недостатком является мутагенным эффект, который флюрохром, сам и, прежде всего, УФ света, используемого для его обнаружения может иметь на клетки.
По всем этим причинам мы искали другие Неинвазивные маркеры, связанные с SN или NSN хроматина конформации, что может заменить использование Hoechst при сохранении высокой классификации точности. Промежуток времени наблюдения цитоплазматических скоростей движения (мезошкала) функция становится отличительной ячейки статуса. Например недавние исследования показали, что связь между мезошкала записан в момент оплодотворения и способность мыши и человека зигот полный предимплантационной и развития доношенных10,11.
Основываясь на этих более ранних исследований, мы опишем здесь платформу для признания развивающих компетентным или некомпетентных мыши взрослой ооциты5,6,,78. Платформа базируется на трех основных шагов: 1) ооцитов, изолированных от полостная фолликулов сначала классифицируются на основе их хроматина конфигурации либо как окружении ядрышко (SN) или не окружении ядрышко (NSN); 2) промежуток времени изображения мезошкала, происходящих во время GV-MII перехода каждого одной яйцеклетки берутся и проанализированы с частиц изображения Велосиметрия (PIV); и 3) данные, полученные с PIV анализируются с канал вперед искусственной нейронной сети (FANN) для слепых классификации12,13. Мы предоставляем подробную информацию о наиболее важных этапов процедуры, предназначенные для мыши, чтобы сделать его готовы для быть протестированы и использованы для других видов млекопитающих (например, говядину, обезьян и людей).
Protocol
Representative Results
Discussion
Существует несколько важных шагов, которые одно должно заботиться о при выполнении настоящего Протокола с ооцитов мыши, а также с представителями других видов. После изолированы от их фолликулов, ооциты должны быть немедленно переданы в записи капли, как разъединение от компаньон куче…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа стала возможной благодаря для поддержки: Университет Павии ФРГ 2016; Пармский университет филь 2014, 2016; и движение за предоставление пластик, необходимые для проведения этого исследования. Мы благодарим д-р Шейн Виндзор (инженерный факультет, Бристольский университет, Великобритания) за предоставление программного обеспечения Cell_PIV.
Materials
| Folligon | Intervet | A201A02 | Hormonal treatment |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | For oocyte heterochromatin staining |
| Cell culture Petri-dish 35 mm x 10 mm | Corning | 430165 | For COCs isolation |
| EmbryoMax M2 Medium (1X), Liquid, with phenol red | Merck-Millipore | MR-015-D | For COCs isolation |
| MEM Alpha medium (1X) + Glutamax | Sigma-Aldrich | M4526 | For oocyte in vitro maturation |
| Cell culture Petri-dish 35 mm glass-bottom | WillCo | GWSt-3522 | For imaging experiments |
| BioStation IM-LM | Nikon | MFA91001 | Live cell screening system |
| Pasteur pipette | Delchimica Scientific Glassware | 6709230 | For follicles manipulation |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | To prevent contamination and medium evaporation |
| Penicillin / Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | To prevent medium contamination |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | ML16141079 | For making up αMEM medium |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030 | For making up αMEM medium |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | For making up αMEM medium |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3310 | For making up αMEM media |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P4562 | For making up αMEM media |
| Zoletil (Tiletamina and Zolazepan cloridrate) | Virbac Srl | QN01AX9 | For mice anesthesia |
| Cell_PIV sofware | Kindly provided by Dr. Shane Windsor, University of Bristol, UK | - | - |
| MATLAB | The MathWorks, Natick, MA | - | For multi-paradigm numerical computing |
References
- Patrizio, P., Fragouli, E., Bianchi, V., Borini, A., Wells, D. Molecular methods for selection of the ideal oocyte. Reprod. Biomed. Online. 15 (3), 346-353 (2007).
- Rienzi, L., Vajta, G., Ubaldi, F. Predictive value of oocyte morphology in human IVF: a systematic review of the literature. Human. Reprod. Update. 17 (1), 34-35 (2011).
- Tan, J. H., et al. Chromatin configurations in the germinal vesicle of mammalian oocytes. Mol. Hum. Reprod. 15 (1), 1-9 (2009).
- Vigone, G., et al. Transcriptome based identification of mouse cumulus cell markers that predict the developmental competence of their enclosed antral oocytes. BMC Genomics. 14, 380 (2013).
- Bui, T. T., et al. Cytoplasmic movement profiles of mouse surrounding nucleolus and not-surrounding nucleolus antral oocytes during meiotic resumption. Mol. Reprod. Dev. 84 (5), 356-362 (2017).
- Zuccotti, M., Piccinelli, A., Giorgi Rossi, P., Garagna, S., Redi, C. A. Chromatin organization during mouse oocyte growth. Mol. Reprod. Dev. 41 (4), 479-485 (1995).
- Zuccotti, M., Garagna, S., Merico, V., Monti, M., Redi, C. A. Chromatin organisation and nuclear architecture in growing mouse oocytes. Mol. Cell. Endocrinol. 234 (1-2), 11-17 (2005).
- Zuccotti, M., Merico, V., Cecconi, S., Redi, C. A., Garagna, S. What does it take to make a developmentally competent mammalian egg?. Hum. Reprod. Update. 17 (4), 525-540 (2011).
- Inoue, A., Nakajima, R., Nagata, M., Aoki, F. Contribution of the oocyte nucleus and cytoplasm to the determination of meiotic and developmental competence in mice. Hum. Reprod. 23 (6), 1377-1384 (2008).
- Ajduk, A., et al. Rhythmic actomyosin-driven contractions induced by sperm entry predict mammalian embryo viability. Nat. Commun. 2, 417 (2011).
- Swann, K., et al. Phospholipase C-ζ-induced Ca2+ oscillations cause coincident cytoplasmic movements in human oocytes that failed to fertilize after intracytoplasmic sperm injection. Fertil. Steril. 97 (3), 742-747 (2012).
- Thakur, A., Mishra, V., Jain, S. K. Feed forward artificial neural network: tool for early detection of ovarian cancer. Sci. Pharm. 79 (3), 493-505 (2011).
- Laudani, A., Lozito, G. M., Riganti Fulginei, F., Salvini, A. On Training Efficiency and Computational Costs of a Feed Forward Neural Network: A Review. Comput. Intell. Neurosci. 2015, 818243 (2015).
