En neurala nätverksbaserade identifiering av utvecklingsmässigt behöriga eller inkompetent mus fullvuxen oocyter
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för icke-invasiv bedömning av äggcell utvecklingsmässiga kompetens under deras i vitro mognad från den germinal vesikler till metafas II scenen. Denna metod kombinerar time-lapse imaging med particle image velocimetry (PIV) och neurala nätverk analys.
Abstract
Infertilitet kliniker skulle dra nytta av möjligheten att välja utvecklingsmässigt behöriga vs. inkompetenta oocyter med icke-invasiva ingrepp, vilket förbättrar det totala resultatet för graviditet. Vi har nyligen utvecklat en klassificeringsmetod baserat på mikroskopiska live observationer av mus oocyter under deras i vitro mognad från germinal vesikler (GV) till metafas II scenen, följt av analysen av de cytoplasmiska rörelserna som inträffar under denna time-lapse period. Här presenterar vi detaljerade protokoll av proceduren. Oocyter är isolerade från fullvuxen antral folliklar och odlade för 15 h inne Mikroskop utrustat för time-lapse analys vid 37 ° C och 5% CO2. Bilderna är tagna med 8 minuters mellanrum. Bilderna analyseras med metoden Particle Image Velocimetry (PIV) som beräknar, för varje äggcell, cytoplasmiska rörelse hastigheter (CMVs) som inträffar under hela kultur profil. Slutligen matas CMVs av varje enda äggcell genom en matematisk klassificeringen verktyg (Feed-forward artificiella neurala nätverk, FANN), som förutsäger sannolikheten för en könscell utvecklingsmässigt behöriga eller inkompetent med en noggrannhet på 91.03%. Detta protokoll, ställa in för musen, kunde nu testas på oocyter från andra arter, inklusive människor.
Introduction
Kvinnlig infertilitet är en patologi som påverkar ett ökande antal kvinnor. Enligt Världshälsoorganisationen är omkring 20% av alla par infertila, med 40% på grund av kvinnlig infertilitet. I tillägg, en tredjedel av kvinnor som genomgår cancerbehandlingar (300.000 per år och 30 000 per år i USA eller Italien, respektive) utveckla prematur ovarialsvikt.
En strategi för att förebygga infertilitet hos cancerpatienter är isolering och Frysförvaring av äggstockscancer folliklar innan onkologisk behandling, följt av in vitro- mognad (IVM) GV oocyter till MII scenen (GV-till-MII övergång). Tillgängligheten av icke-invasiva markörer för äggcell utvecklingsmässiga kompetens skulle förbättra befruktningen och utvecklingsprocesser och övergripande graviditet framgång1,2.
Baserat på deras kromatin-konfiguration som observerats efter färgning med den supravital fluorokrom Hoechst 33342, däggdjur fullvuxen oocyter klassificeras antingen som en omges Nucleolus (SN) eller en inte omgiven Nucleolus (NSN)3. Förutom deras olika kromatin organisation Visa dessa två typer av oocyter många morfologiska och funktionella skillnader3,4,5,6,7,8 ,9, inklusive deras meiotiska och utvecklingsmässiga kompetens. När isolerade från äggstocken och mognat i vitro, både typ av oocyter reach MII scenen, och efter sperm insemination, utvecklas till ett 2-cells Stadium, men endast de med en SN kromatin organisation kan utvecklas till termen9. Även bra som en klassificeringsmetod för att välja behöriga vs. inkompetenta oocyter, är den största nackdelen mutagen effekt som fluorokrom själv och, framför allt UV-ljus används för dess upptäckt kanske på cellerna.
Av alla dessa skäl sökte vi andra icke-invasiva markörer associerade med SN eller NSN kromatin konformation som kunde ersätta användningen av Hoechst samtidigt bibehålla samma höga klassificering noggrannhet. Time-lapse observationen av cytoplasmisk rörelse hastigheter (CMVs) framstår som en funktion särskiljande av cell status. Till exempel visat nyligen genomförda studier sambandet mellan CMVs registreras vid tiden för befruktning och mus och mänskliga zygoter kapacitet till komplett preimplantatorisk och fullgångna utveckling10,11.
Baserat på dessa tidigare studier, beskriver vi här en plattform för erkännande av utvecklingsmässigt behöriga eller inkompetent mus fullvuxen oocyter5,6,7,8. Plattformen bygger på tre huvudsakliga steg: 1) oocyter som isolerats från antral folliklar klassificeras först utifrån deras kromatin konfiguration antingen som en omgiven nucleolus (SN) eller en inte-omgiven nucleolus (NSN); (2) time-Lapse bilder av CMVs som inträffar under GV-till-MII övergången av varje enda äggcell tas och analyseras med particle image velocimetry (PIV); och 3) data som erhållits med PIV analyseras med en Feed-forward artificiella neurala nätverk (FANN) för blinda klassificering12,13. Vi redogör för de viktigaste stegen i förfarandet för musen för att göra det redo att testas och används för andra däggdjursarter (t.ex. nötkreatur, apa och människa).
Protocol
Representative Results
Discussion
I området i närheten finns det flera kritiska steg man bör ta hand om medan du utför detta protokoll med musen oocyter samt med de av andra arter. När isolerade från sin folliklar, oocyter omedelbart bör överföras till inspelning dropparna som avskiljandet från de följeslagare cumulus celler utlösare i början av GV-till-MII övergången. En möjlig ändring i detta protokoll kan vara tillsats av 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) till M2 medium används för COC isolering. IBMX förhindrar omedelbar utlösni…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete gjordes möjligt tack vare stöd av: universitetet i Pavia FRG 2016. Universitetet i Parma FIL 2014 2016. och Kinesis för att tillhandahålla plasticware som är nödvändiga för att genomföra denna studie. Vi tackar Dr Shane Windsor (tekniska fakulteten, universitetet i Bristol, UK) för att tillhandahålla Cell_PIV programvara.
Materials
| Folligon | Intervet | A201A02 | Hormonal treatment |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | For oocyte heterochromatin staining |
| Cell culture Petri-dish 35 mm x 10 mm | Corning | 430165 | For COCs isolation |
| EmbryoMax M2 Medium (1X), Liquid, with phenol red | Merck-Millipore | MR-015-D | For COCs isolation |
| MEM Alpha medium (1X) + Glutamax | Sigma-Aldrich | M4526 | For oocyte in vitro maturation |
| Cell culture Petri-dish 35 mm glass-bottom | WillCo | GWSt-3522 | For imaging experiments |
| BioStation IM-LM | Nikon | MFA91001 | Live cell screening system |
| Pasteur pipette | Delchimica Scientific Glassware | 6709230 | For follicles manipulation |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | To prevent contamination and medium evaporation |
| Penicillin / Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | To prevent medium contamination |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | ML16141079 | For making up αMEM medium |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030 | For making up αMEM medium |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | For making up αMEM medium |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3310 | For making up αMEM media |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P4562 | For making up αMEM media |
| Zoletil (Tiletamina and Zolazepan cloridrate) | Virbac Srl | QN01AX9 | For mice anesthesia |
| Cell_PIV sofware | Kindly provided by Dr. Shane Windsor, University of Bristol, UK | - | - |
| MATLAB | The MathWorks, Natick, MA | - | For multi-paradigm numerical computing |
References
- Patrizio, P., Fragouli, E., Bianchi, V., Borini, A., Wells, D. Molecular methods for selection of the ideal oocyte. Reprod. Biomed. Online. 15 (3), 346-353 (2007).
- Rienzi, L., Vajta, G., Ubaldi, F. Predictive value of oocyte morphology in human IVF: a systematic review of the literature. Human. Reprod. Update. 17 (1), 34-35 (2011).
- Tan, J. H., et al. Chromatin configurations in the germinal vesicle of mammalian oocytes. Mol. Hum. Reprod. 15 (1), 1-9 (2009).
- Vigone, G., et al. Transcriptome based identification of mouse cumulus cell markers that predict the developmental competence of their enclosed antral oocytes. BMC Genomics. 14, 380 (2013).
- Bui, T. T., et al. Cytoplasmic movement profiles of mouse surrounding nucleolus and not-surrounding nucleolus antral oocytes during meiotic resumption. Mol. Reprod. Dev. 84 (5), 356-362 (2017).
- Zuccotti, M., Piccinelli, A., Giorgi Rossi, P., Garagna, S., Redi, C. A. Chromatin organization during mouse oocyte growth. Mol. Reprod. Dev. 41 (4), 479-485 (1995).
- Zuccotti, M., Garagna, S., Merico, V., Monti, M., Redi, C. A. Chromatin organisation and nuclear architecture in growing mouse oocytes. Mol. Cell. Endocrinol. 234 (1-2), 11-17 (2005).
- Zuccotti, M., Merico, V., Cecconi, S., Redi, C. A., Garagna, S. What does it take to make a developmentally competent mammalian egg?. Hum. Reprod. Update. 17 (4), 525-540 (2011).
- Inoue, A., Nakajima, R., Nagata, M., Aoki, F. Contribution of the oocyte nucleus and cytoplasm to the determination of meiotic and developmental competence in mice. Hum. Reprod. 23 (6), 1377-1384 (2008).
- Ajduk, A., et al. Rhythmic actomyosin-driven contractions induced by sperm entry predict mammalian embryo viability. Nat. Commun. 2, 417 (2011).
- Swann, K., et al. Phospholipase C-ζ-induced Ca2+ oscillations cause coincident cytoplasmic movements in human oocytes that failed to fertilize after intracytoplasmic sperm injection. Fertil. Steril. 97 (3), 742-747 (2012).
- Thakur, A., Mishra, V., Jain, S. K. Feed forward artificial neural network: tool for early detection of ovarian cancer. Sci. Pharm. 79 (3), 493-505 (2011).
- Laudani, A., Lozito, G. M., Riganti Fulginei, F., Salvini, A. On Training Efficiency and Computational Costs of a Feed Forward Neural Network: A Review. Comput. Intell. Neurosci. 2015, 818243 (2015).
