Summary
Sæd LNG kreves for sædcellene å bli frigjort fra banebrytende gel. Denne studien gir prosedyrer for innsamling av sæd fra den kvinnelige skjede etter samleie og måle sæd LNG tid.
Abstract
I mus, settes utbrøt sæd inn i livmoren. Etter utløsning, sæd endres konsistens fra gel-lignende til vannaktig, en prosess som kalles LNG. I denne studien viser vi hvordan du samler etter utbrøt sæd fra den kvinnelige skjede i en musemodell. Første, voksen kvinnelig mus i estrus scenen ble plassert i en mannlig bur over natten. Neste morgen, bekrefter copulation tilstedeværelsen av copulatory plug ved skjedeåpningen. Kvinnelige mus med copulatory plugger ble euthanized, og hver skjede var samlet som helhet (vagina, livmor, oviducts, eggstokkene), sikrer et lukket system inneholder sæd. Skjede ble plassert i en 1,5 mL microcentrifuge rør, og skjeden ble avskåret for å løslate sæd inn i røret. For å sikre maksimal sæd volum for analyse, ble tannløs tang brukt til å presse livmor hornene fra eggstokkene slutten vaginal slutten utviste gjenværende sæd. Det hele skjede ble deretter forkastet. Sæd inneholder røret ble kort spunnet ned. En 25 μL kapillær pipette ble satt inn i røret i 180° vinkel (parallell til veggen rør). Tiden som brukes til å fylle kapillær røret til 25 μL linjen ble registrert. Sæd fra en bevist mannlige oppdretter tar vanligvis ca 60-180 s å fylle en 25 μL kapillær rør. Denne sæd samling teknikken kan også brukes i andre nedstrøms programmer som sperm bildebehandling og motilitet analyse.
Introduction
Den kvinnelige skjede består av de øvre og nedre områder. Den øvre reproduktive område inkluderer Fallopian rør og livmoren i livmorhalsen. Den lavere skjede inkluderer ectocervix og vagina. Hos mennesker brukes utbrøt sæd på fremre veggen av skjeden, tilstøtende til ectocervix1. I mus, men er semen feiet inn i livmoren minutter etter mating2.
Inneholder sæd seminal gel som er styrket innen sekunder etter utløsning, forårsaker sæd å bli fanget og immobilisert3. LNG utgivelser immobilisert sæd ved å endre sæd fra en gel-lignende til en vannaktig konsistens. Denne prosessen er avgjørende for Spermiemotilitet og pattedyr reproduksjon. Kunnskap om sæd LNG er hovedsakelig basert på i vitro studier der sæd blir flytende i en kultur parabol. Hos mennesker er den enzymatiske aktiviteten av prostata spesifikke antigen eller PSA (også kjent som kallikrein-relaterte peptidase 3 eller KLK3) den viktigste bidragsyteren for LNG gjennom hydrolyse av semenogelins (gel-forming proteiner i sæd)4 ,5,6. Nedbrytning av semenogelins utvikles sperm fra den banebrytende coagulum, øke sæd mobilitet. Frigjort sperm svømme mot Fallopian tube å befrukte egget. LNG (eller sæd viskositet) testene er en av de standard første screenings for semen analyse i fruktbarhet klinikker å vurdere mannlig fertilitet7.
En nylig publisert artikkel viser at analyse av seminal væske fra kvinnelige musen skjede etter mating kan brukes til å illustrere en mangel på LNG som kan deretter føre fruktbarhet defekter8. Defekt LNG som sæd hyperviscosity bidrar til 11,8-32,3% av ufruktbar tilfeller i menn9, antyder at normal LNG er uunnværlig for pattedyr reproduksjon. Men har studier og behandling av LNG defekter fokusert utelukkende på mannlige7. Muligheten for at den kvinnelige skjede spiller en rolle i sæd LNG har ikke blitt utforsket. Derfor vil metodene for semen samling og måling LNG tid gi forskerne en roman Diagnoseverktøy for å fastslå om LNG kan være en av årsakene til ufruktbarhet i modellen organismen rundt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr og prosedyrer brukes i denne studien ble håndtert i henhold til Washington State University (WSU) Animal Care og bruk komiteen retningslinjer og i samsvar med WSU godkjent dyr protokoller #4702 og #4735.
1. mus
-
Bruk standard C57BL/6J voksne mannlige mus eller andre stammer rundt. Opprettholde dyr under en temperatur og fuktighet-kontrollert miljø, med annonsen libitum tilgang til vann og mat.
- Bruk mannlige oppdrettere mellom 8 uker gamle 10 måneder gammel. Bruk bare anerkjent oppdretter i forsøkene.
-
Bruke voksne kvinnelige mus med en vev selektiv sletting av skjede østrogen reseptor î± (kodet av Esr1 genet) i epitelceller10 (Wnt7agrobunn / +; Esr1f/f, kalt knockout eller "KO") og kontrollere littermates (Esr1f/f, kalt "CTRL") i denne studien.
- Bruk 8 uke-gamle kvinner. Alderen kvinner variert avhengig av eksperimentet av interesse.
- Bestemme stadier av estrous syklusen i morgen kl 08:00 h. Bruk bare kvinner på estrus scenen av syklusen. Detaljert metoder for vaginal smøre og fargemaskin analyse, se de tidligere publiserte prosedyrer11.
2. mating og vurdere Copulatory plugger
- På dagen for estrus (16:00 h), huset kvinner i en mannligs bur.
- Neste morgen (08:00 h), separate kvinnelige fra mannlige musen.
- Bruk en tilpasning av en tidligere publiserte metoden12 til tilstedeværelse eller fravær av vaginal eller copulatory plug-in som en indikasjon på parring.
- Hold kvinnelige musen fra foten av halen å kort løfte bakbeina.
- Finne copulatory plug av tilstedeværelsen av et off-white banebrytende coagulum ved skjedeåpningen med en tannpirker. Hvis copulatory pluggen, kan tannpirker ikke settes inn i vaginale kanalen.
3. forberedelser før vev samling
- Forberede 10 mL av Leibovitz's L-15 media, med 1% fosterets bovin serum (kalt L15 media + 1% FBS) i en 15 mL tube. Inkuber medier på 37 ° C i 15 min i en waterbath.
- For å bevare levedyktigheten til vev og sperm for nedstrøms programmer, aliquot 2 mL forvarmes L15 media + 1% FBS i en 2 mL microcentrifuge rør for vev samling.
- Varme scenen av stereomicroscope til 37 ° C. Angi varme-blokken 37 ° c og plassere en tom 1,5 mL microcentrifuge rør i blokken.
- Hvis nedstrøms programmene krever avbilding av Spermiemotilitet, varme av objektglass til 37 ° C.
4. vev samling
- Bringe forvarmes L15 media + 1% FBS aliquot vevet samling området.
- Euthanize kvinnelige (~ 08:30 timer) bruker karbondioksid kvelning etterfulgt av cervical forvridning.
Merk: Dette er ca 8 timer etter parring, forutsatt at paringa finner sted ved midnatt. - Plassere dyret i supine posisjon til å avdekke mageområdet.
- Spray 70% alkohol på magen nær bakbeina.
- Bruke dissecting saksen for å gjøre et lite kutt (~ 1 cm) på huden i nedre del av magen.
- Bruk den dominante hånden for å trekke hale (og bakbeina eventuelt) mens ikke-dominante hånd trekker huden i motsatt retning (hodet) for å avsløre abdominal muskler. Denne metoden brukes til å minimere mengden av hår forurensning til visceral organer.
- Kutt bukmuskel i en V-form ved foten av magen, ved siden av skjeden, å avsløre visceral organer.
- Flytte tarmen og abdominal fett til side å avsløre skjede.
- Klippe av blæren og andre vev over vaginal området.
- Kuttet kjønnshår symphysis fra hverandre for å få tilgang til vaginal vev.
- Løfte vaginale vev ved skjedeåpningen og bruke saks for å skille de vaginal kanalen fra endetarms vevet.
- Nøye klippe av hvem fettet fra begge sider av livmoren med våren saks.
FORSIKTIG: Livmoren er svært skjøre med sæd inn. Pass på å ikke punktere livmoren, eller andre sæd går tapt. - Løft den lavere skjede og kutte ovarian fett puten på begge sider.
- Overføre hele skjede inn i røret forvarmes Leibovitz L-15 media + 1% FBS.
5. måling av sæd LNG (viskositet) fra livmor innholdssamling
- På oppvarmet scenen på stereomicroscope, varmet overføring vev i en 35 mm sterilt vev kultur parabol fylt med 3,5 mL pre L-15 media + 1% FBS å rengjøre vev av blod og andre forurensninger.
FORSIKTIG: Under vasking, ta vev av fettet, ikke i livmoren. På dette punktet, sæd forventes være intakt inne i livmoren. - Blot vev av overflødig medier med laboratoriet kluter.
- Hold vev på vaginal slutten mens plassere ovarian ender i forvarmet microcentrifuge røret. Mens du holder vaginal slutten, kutt livmor hornene ved foten av livmoren, slik at livmor hornene å falle i microcentrifuge røret.
- La sæd flyt av livmor hornene inn i røret. Bruk tannløs tang til å forsiktig presse livmor hornene fra eggstokkene slutten på vaginal slutten, utvise ut leftover sæd.
- Forkast vev i biohazard bag og Brenn.
- Kort Nedspinning sæd i en minicentrifuge (~ 1-2 s).
- Lå røret, parallelt med oppvarmet scenen - sæd vil ikke søler ut.
- Har timeren klar og satt til "telle opp".
- En 25 µL kapillær rør inn sæden i 180° vinkel (parallelt til røret veggen). Dette er å minimere variasjon mellom hver etterforsker holder kapillær røret på ulike vinkler.
- Trykk timeren snarest kapillarrør gjør kontakt med sæd.
- Registrere tiden (s) det tar for sæden å nå 25 µL linjen.
- Når målet er fullført, umiddelbart legge røret som inneholder sæd tilbake i tørr blokken for ytterligere funksjonsanalyse som video avbilding av Spermiemotilitet.
- Desinfiser kapillær røret som inneholder sæd ved immersing røret i 10% bleike løsning for 20 min og kast kapillær røret i beholderen.
6. video avbilding av Spermiemotilitet
- Slå på mikroskopet og video tenkelig programvare.
- Pipetter 20 µL av gjenværende sæd inn i forvarmes glass lysbildet, mens av objektglass plasseres på oppvarmet scenen.
- Dekk med et glass dekkglassvæske.
- Plass slide dekkglassvæske siden på mikroskopet.
- Bruk 20 X linsen for å finne interesseområde.
- Endre til 100 X linsen for video tenkelig.
- Ta opp video på 12 rammer/s (fps) for 30 s.
- Tilfeldig inn videoer i minst 3 ulike områder per dyr.
- Utføre avbilding raskt og minimere eksponering i lysbildet for å bevare Spermiemotilitet og levedyktighet.
Merk: Denne tenkelig fremgangsmåten bør gjøres innen 2-3 min. - Utføre dataanalyse bruker ImageJ programvare som tidligere beskrevet8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sæd ble samlet inn fra CTRL og KO kvinner ca 8 h, etter parring med fruktbare CTRL menn. LNG (eller sæd viskositet) er kvantifisert av tiden det tar å fylle 25 μL kapillær tube med sæd. Sæd fra CTRL uteri tok 2.06 ±0.12 min (mean±S.E.M, n = 5) å fylle kapillarrør (figur 1). Imidlertid sæd fra KO uteri tok mer enn 60 min (60.0 ±0.0, mean±S.E.M, n = 5) eksperimentelle tid. Disse data tyder på at sæd er betydelig mer flytende eller mindre tyktflytende i CTRL forhold til KO uteri.
For å illustrere en av nedstrøms programmer samle sæd fra den kvinnelige skjede, ble Spermiemotilitet vurdert med video imaging. Sæd samlet fra CTRL uteri viste fritt-svømming sperm innen mikroskopiske, representert i det statiske utvalget i figur 2A. Sæd fra KO uteri viste at fleste av sperm ble gruppert sammen med minimal mobilitet (figur 2B). Disse funnene tyder på at sæd samlet fra den kvinnelige skjede 8 timer etter parring kan brukes til videre sperm analyse.
Figur 1 : LNG tid (sæd viskositet) fra sæd samlet fra mus uteri. Grafisk fremstilling av LNG tid (min) av sæd samlet fra CTRL og KO uteri ca 8 h etter parring. Dataene representerer mean±S.E.M., n = 5 kvinner/anleggspreg. p < 0,001, unpaired Student t -test. Tilpasset fra tidligere publiserte resultatene8 med tillatelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Representant bilder av sæd i sæd samlet fra mus uteri. Representant snapshots fra video avbilding tatt på 1000 X forstørrelse av sæd i sæd samlet fra (A) CTRL og (B) KO uteri. Tilpasset fra tidligere publiserte resultatene8 med tillatelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Samle sæd fra mus uteri kan gi fordeler over semen analyse i vitro som tidligere kan illustrere fysiologiske samspillet mellom sæd og sekret fra den kvinnelige skjede. Teknikker som presenteres i denne studien at forskerne å avgjøre sædkvalitet samt sperm levedyktighet og motilitet i ideelle fysiologiske forhold. Videre finnes det forskjellige nedstrøms analyser som utføres med sæd fra uteri, for eksempel sperm kan bli regnet for å fastslå hvor faktiske sæd inn i livmoren og sperm kan også avbildes for motilitet analyser. Det ideelle tidspunktet å samle sæd for befruktning kapasitet skal innen 1-2 timer etter mating1.
I tillegg til de nevnte nedstrøms programmene, etterforskere kan også evaluere effekten av hemmere/forbindelser rundt på sperm transport forretningsprosesser, for eksempel sæd LNG (eller sæd viskositet), sperm tall i skrift, sperm motilitet eller sædceller migrasjon til forskjellige områder i den kvinnelige skjede. Forbindelsene kan brukes i den kvinnelige skjede før parring8. Deretter kan virkningen av de hemmere/forbindelsene vurderes fra sæden etter mating. Disse metodene kan være nyttig å teste praktisk bruk av Prevensjon medisiner som hemmer sperm transport.
Sentrale punkter av hensyn til sæd samling og LNG/viskositet målinger er følsomheten til sperm og vinkelen på kapillarrør. Sperm er følsom for temperatur endring. Hvis nedstrøms analyse av sæd funksjon og motilitet er avgjørende for eksperimentelle resultater, vev og sæd må holdes på 37 ° C hele tiden, med minimal eksponering for lys. Hvis det er flere prøver å samle fra flere kvinner, avlive dyrene en for å redusere ventetiden. For LNG måling generere ulike vinkler av kapillær røret inkonsekvenser i LNG tid. Derfor har etterforskerne å holde kapillarrør parallelt tube veggen (i 180° vinkel) for å minimere variasjon opprettet av hver etterforsker. Sædprøve bør ikke hentes senere enn 09:00 h, dette skyldes den flytende reabsorpsjon i livmoren. Etterforskeren kan ikke få nok væske materiale for LNG måling.
Det fastslås at sæd LNG er hovedsakelig mediert av den enzymatiske aktiviteten til PSA skilles ut fra prostate kjertel13. Det er imidlertid begrenset studier for å avgjøre rollene til kvinnelige skjede under i vivo LNG prosessen8. Samling av sæd fra den kvinnelige skjede gir derfor en avgjørende fordel å studere LNG prosesser i vivo, etter sæden har vært utsatt for sekret fra den kvinnelige skjede14. I konklusjonen, kan etter utbrøt sæd LNG/viskositet måling forskerne å dechiffrere samspillet mellom sæd og den kvinnelige skjede.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet er støttet av College av Veterinary medisin (WSU) oppstart fondet WW. Forfatterne takker Sierra Olsen (WSU) for kritisk lesning av dette manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Toothpick | Diamond | 750-Flat | Autoclaved sterile, use blunted toothpick. Do not use point-ended |
| Dissecting scissors | Fisher | 08-940 | |
| Spring scissors | Roboz | RS-5600 | |
| Fine forceps | Roboz | RS-5045 | |
| 25-μL glass capillary tube | VWR | 53432-761 | |
| Leibovitz’s L-15 media | Life Technologies | 11415064 | Supplement with 1% FBS |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| 1.5-mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| 2-mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-200-A | |
| Digital dry block heater | VWR | 13259-052 | For warming the microcentrifuge tube prior to semen collection |
| Minicentrifuge | Corning | LSE 6765 | |
| 35-mm culture dish | VWR | 10861-656 | |
| 15-mL polypropylene centrifuge tube | VWR | 10025-686 | |
| Waterbath | Precision | TSGP05 | |
| Heated stage stereomicroscope | Leica Microsystems | MZ10F | To keep the tissue warm prior to semen collection |
| Brightfield microscope | Leica Microsystems | DMi8 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Camera | Leica Microsystems | DMC2900 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Glass slides | Fisher | 12-552-3 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Coverslip | VWR | 48393-059 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Bleach | Dilute in dH2O to 10% concentration |
References
- Suarez, S. S., Pacey, A. A. Sperm transport in the female reproductive tract. Hum Reprod Update. 12 (1), 23-37 (2006).
- Bedford, J. M., Yanagimachi, R. Initiation of sperm motility after mating in the rat and hamster. J Androl. 13 (5), 444-449 (1992).
- Lilja, H.
- Lilja, H., Abrahamsson, P. A., Lundwall, A. Semenogelin, the predominant protein in human semen. Primary structure and identification of closely related proteins in the male accessory sex glands and on the spermatozoa. J Biol Chem. 264 (3), 1894-1900 (1989).
- Veveris-Lowe, T. L., Kruger, S. J., Walsh, T., Gardiner, R. A., Clements, J. A. Seminal fluid characterization for male fertility and prostate cancer: kallikrein-related serine proteases and whole proteome approaches. Semin Thromb Hemost. (33), 87-99 (2007).
- Emami, N., Deperthes, D., Malm, J., Diamandis, E. P. Major role of human KLK14 in seminal clot liquefaction. J Biol Chem. 283 (28), 19561-19569 (2008).
- Gerhard, I., Roth, B., Eggert-Kruse, W., Runnebaum, B. Effects of kallikrein on sperm motility, capillary tube test, and pregnancy rate in an AIH program. Arch Androl. 24 (2), 129-145 (1990).
- Li, S., Garcia, M., Gewiss, R. L., Winuthayanon, W. Crucial role of estrogen for the mammalian female in regulating semen coagulation and liquefaction in vivo. PLoS Genet. 13 (4), e1006743 (2017).
- Elia, J., et al. Human semen hyperviscosity: prevalence, pathogenesis and therapeutic aspects. Asian J Androl. 11 (5), 609-615 (2009).
- Winuthayanon, W., Hewitt, S. C., Orvis, G. D., Behringer, R. R., Korach, K. S. Uterine epithelial estrogen receptor alpha is dispensable for proliferation but essential for complete biological and biochemical responses. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (45), 19272-19277 (2010).
- McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. Performing vaginal lavage, crystal violet staining, and vaginal cytological evaluation for mouse estrous cycle staging identification. J Vis Exp. (67), e4389 (2012).
- JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Fundamentals of Breeding and Weaning. JoVE. , Cambridge, MA (2017).
- Prassas, I., Eissa, A., Poda, G., Diamandis, E. P. Unleashing the therapeutic potential of human kallikrein-related serine proteases. Nat Rev Drug Discov. 14 (3), 183-202 (2015).
- Muytjens, C. M., Vasiliou, S. K., Oikonomopoulou, K., Prassas, I., Diamandis, E. P. Putative functions of tissue kallikrein-related peptidases in vaginal fluid. Nat Rev Urol. 13 (10), 596-607 (2016).
