聴性脳幹反応と生後ラットの外有毛細胞細胞パッチ ・ クランプ記録
Summary
このプロトコルは、生後ラットの聴性脳幹反応を記録する方法を説明します。外有毛細胞の機能の発達を調べると、全細胞パッチク ランプ分離外有毛細胞内記録の実験の手順がステップバイ ステップで説明されています。
Abstract
外の有毛細胞は哺乳類の蝸牛の感覚毛の細胞の 2 つのタイプの 1 つです。彼らは、低レベルの音声信号の弱い振動を増幅する潜在的な受容体とそのセルの長さを変更します。形態と内耳外有毛細胞の電気生理学的特性は、産後の早い年齢で開発します。外有毛細胞の成熟聴覚システムの開発に貢献するかもしれない。しかし、内耳の開発のプロセスはよく研究されていません。これは電気生理学的アプローチによるそれぞれの機能を測定する難しさの一因です。上記の問題を解決する簡単な方法を開発することを目的としてここで我々 は生後ラット急性解離の蝸牛における内耳の機能を勉強する段階的なプロトコルをについて説明します。この方法では、純音刺激の蝸牛神経の反応を評価し、表現レベルと強大でタンパク質モータプレスチンの機能を調べる。このメソッドは、内部の有毛細胞 (Ihc) を調査にも使用できます。
Introduction
哺乳類の聴覚の感覚の蝸牛の有毛細胞の 2 つの異なる機能が欠かせない: mechanoelectric 伝達 (MET) と electromotility1,2。MET チャネル髪束、Ihc (Ihc), 変換音振動膜電位変化と神経らせん神経節細胞の電気信号であります。内耳膜電位とそのセルの長さを変更し、低音の振動を増幅します。Electromotility と呼ばれるこの活動は,3の外側の壁にあるタンパク質モータプレスチンによって派生します。
齧歯動物を含む多くの種で、公聴会の関数は初期産後エポック4,5に未熟です。聴覚発症6、7の前に聴覚野における音声信号への応答で活動電位が検出されません。形態の開発と蝸牛の機能はラット4,5,8スナネズミ、マウスで広く研究されています。メカノトランスダクションと有毛細胞の electromotility の初期の開発もエポック社の生活の5。
生後隔世でラットの聴覚感度を評価するためにラット記録脳幹反応 (ABR) の手法を提案します。全細胞パッチク ランプは、生理、内耳を調査する理想的な技術です。ただし、ニューロンと他の上皮細胞で実行パッチ クランプと比べると、全体携帯シールの低率は分離強大の electromotility の調査を制限しました。
ここで我々 は生後ラット急性解離の蝸牛の形態と生理、内耳を調査する手順をについて説明します。このメソッドは、内部の有毛細胞の開発と機能を制御する分子機構を研究する変更できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
11 日目より若いラット、聴覚野6,7で音刺激電位が観察できません。したがって、生後 11 日目は、「聴覚発症”10として記述されます。聴覚の発症がよくまだ研究されていない前に聴覚機能の開発。大人の ABR 記録のため同様のメソッドを使用して、Abr が仔 P11 より若いから純粋なトーン バーストによって誘発されることを示す (<stro…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、973 プログラム (2014CB943002) と、国家自然科学基金、中国の (11534013、31500841) からの助成金によって支えられました。
Materials
| Anesthetic | |||
| Pentobarbital sodium | Sigma | P3761 | 1.5% in water |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection solution | |||
| Leiboviz's L-15 Medium | Life Technologies | 41300-039 | 1 pack in 1 L water |
| Collagenase IV | Sigma | C5138 | 2 mg/mL in L-15 |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | 10 mM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunostaining solutions | |||
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | PH 7.3 |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | 4% in PBS |
| Triton X-100 | Amresco | ZS-0694 | 0.3% in PBS |
| Normal goat serum | Thermo Fisher Scientific | 10000C | 10% in PBS |
| prestin antibody | Santa Cruz | SC-22694 | dil 1:200 |
| Alexa Fluor 488-conjugated antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11055 | dil 1:600 |
| Phalloidin-Tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma | P1951 | dil 1:200 |
| DAPI | Solarbio | C0060 | dil 1:20 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Extracellular solution | |||
| Leiboviz's L-15 Medium | Life Technologies | 41300-039 | 1 pack in 1 L water |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | 10 mM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Intracellular solution | |||
| CsCl | Sigma | 7647-17-8 | 140 mM |
| MgCl2 | Sigma | 7791-18-6 | 2 mM |
| EGTA | Sigma | 67-42-5 | 10 mM |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | 10 mM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Osmometer | Gonotec | OSMOMAT 3000 basic | |
| Forcep | WPI | 14095 | Tweezers dumont |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | MODLE-P97 | |
| Micro Forge | Narishigen | MF-830 | |
| Mini Operating System | Sutter Instrument | MP-285 | |
| MultiClamp | Axon | 700B | |
| Low-Noise Data Acquisition System | Axon | 1440A | |
| ES1 speaker | Tucker-Davis Technologies | ||
| TDT system 3 | Tucker-Davis Technologies | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| SigGenRP software | Tucker-Davis Technologies | ||
| BioSigRP software | Tucker-Davis Technologies | ||
| jClamp | Scientific Solutions | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal | |||
| SD rat | Experimental Animal Center of Southern Medical University |
References
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