이 프로토콜에는 출생 후 쥐 새끼에서 청각 brainstem 응답을 기록 하는 방법을 설명 합니다. 외부 머리 세포의 기능 개발 조사, 고립 된 외부 머리 세포에 기록 하는 전체 셀 패치 클램프 실험 절차 단계별 설명 합니다.
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이 논문에서
요약
초록
외부 머리 세포 포유류 달팽이 관의 감각 세포의 두 종류 중 하나입니다. 그들은 약한 진동의 저수준 사운드 신호를 증폭 하는 잠재적인 수용 체와 그들의 셀 길이 변경 합니다. 형태학 및 electrophysiological 속성 외부 머리 세포 (OHCs)의 이른 출생 후 년에 발전 한다. 외부 머리 세포의 성숙 청각 시스템의 발전에 기여할 수 있습니다. 그러나, OHCs 개발의 과정은 잘 공부 하지. 이 부분적으로 electrophysiological 접근 하 여 그들의 기능을 측정 하는 데 어려움입니다. 위의 문제를 해결 하는 간단한 방법을 개발, 목적 여기 우리가 출생 후 쥐에서 심하게 천연된 달팽이 관에서 OHCs의 기능을 공부 하는 단계별로 프로토콜을 설명 합니다. 이 방법으로 순수 톤 자극에 인공 응답을 평가 하 고 식 수준 및 OHCs에 모터 단백질 prestin의 기능 검사 수 있습니다. 이 메서드는 또한 내부 세포 (IHCs) 조사를 사용할 수 있습니다.
서론
달팽이 관의 감각 세포의 두 가지 기능 포유류 청각을 위해 필수적입니다: mechanoelectric 변환 (메트로) 및 electromotility1,2. 메트로 채널 머리 번들, IHCs (IHCs) 및 막 잠재적인 변경으로 OHCs 변환 사운드 진동 뿐만 아니라 innervated 나선형 ganglion 신경의 전기 신호에 의해 OHCs 막 잠재력과 셀 길이 변경 하 고 낮은 수준의 소리의 진동 증폭. Electromotility 나이 활동 OHCs3의 측면 벽에 있는 모터 단백질 prestin에 의해 파생 됩니다.
많은 종의 설치류를 포함 하 여, 청각 기능 초기 산 후 신 기원4,5에 성숙 하지 않습니다. 사운드 신호에 대응에서 행동 잠재력 심리 발병6,7전에 청각 피 질에서 검출 될 수 있습니다. 형태학의 개발 및 달팽이 관의 기능 마우스, 햄스터, 쥐
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프로토콜
동물 주제와 관련 된 모든 실험 프로토콜 남부 의과대학의 동물 윤리 위원회에 의해 승인 되었다.
1. 실험에 대 한 솔루션을 준비 합니다.
- 마 취 준비 ( 재료의 표참조): 1.5 %pentobarbital 나트륨 ddH2오에에서 녹아
- 해 부 솔루션 준비 ( 재료의 표참조): 1 M NaOH와 ddH2O. 조절 pH 7.3 1 리터에 Leiboviz의 L-15 분말의 1 개의 부 대를 해산. 300-330 mOsm osmolarity osmometer를 사용 하기 전에 10 mM HEPES 사용 하 여 조정 합니다.
- 2 mg/mL 콜라 IV 해산 ( 재료의 표참조) 해 부 솔루션 단계 1.2 준비.
- ( 재료의 표참조) immunostaining 솔루션 준비: 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)에 4 %paraformaldehyde 해산.
주의: Paraformaldehyde은 독성; 적절 한 보호를 착용 하십시오. - 0.3% 침투성 에이전트 PBS에 희석. 블로킹 버퍼 PBS에 10% 정상 염소 ....
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결과
ABR에서 마 취 쥐 새끼 산 후 제 7 일 보다 오래 된 (P7) 순수한 톤 버스트 (그림 1A)를 사용 하 여 elicited 될 수 있습니다. 그림 1B같이 ABR 파형 쥐 새끼만 3 ~ 4 가지 파도 작은 진폭 보여준에서 얻은. 일반적으로, 7 개의 봉우리까지 성인 동물 (그림 1B)의 ABR 파형에서 관찰 되었다.
다음 immunostaining 및 electrophysiological 측정, 쥐 귀 갓 측 뼈에서 해 부 했다. 우리는 SV를 modiolus (그림 2A-2 C) OC.......
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토론
쥐 날 11 미만, 청각 피 질6,7소리 자극에 대 한 응답에서 행동 잠재력을 관찰 수 있었다. 따라서, 출생 후 하루 11 "청각 발병"10로 설명 되어 있습니다. 청각 기능 공부 하기 전에 청력 발병은 하지 잘 아직 개발. 성인 ABR 녹음에 대 한 유사한 방법을 사용 하 여, Abr P11 보다 젊은 쥐 새끼에서 순수한 톤 버스트 여 elicited 될 수 보여 줍니다 (그림 1). 그러나, 쥐 새끼에서 얻은 ABR 파형 성인 동물의 몇 가지 다른 기능을 보여주었다. ABR 응답은 상대적으로 높은 임계값과 진폭에 작은. 이 결과 개발 청각 시스템 사운드 신호를 낮은 감도 것을 의미 합니다. 중요 한 차이 쥐 새끼에서 기록 하는 ABR 파형에서 관찰 되었다. 일반적으로, 7 개의 봉우리까지 성인 ABR 파형
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
이 작품은 973 프로그램 (2014CB943002), 국립 자연 과학 재단의 중국 (11534013, 31500841)에서 교부 금에 의해 지원 되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 마취 | |||
| 펜토바르비탈 나트륨 | 시그마 | P3761 | 1.5% 수중 |
| Name | Company | 카탈로그 번호 | Comments |
| Dissection solution | |||
| Leiboviz의 L-15 Medium | Life Technologies | 41300-039 | 1 팩 1 L 물 |
| 콜라겐 분해 효소 IV | 시그마 | C5138 | 2 mg/mL in L-15 |
| HEPES | 시그마 | 7365-45-9 | 10 |
| mMName | Company | 카탈로그 번호 | 코멘트 |
| Immunostaining solutions | |||
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | PBS |
| Triton X-100 | Amresco | ZS-0694 | PBS |
| 포름알데히 | 158127 | ||
| 프레스틴 항체 | Santa Cruz | SC-22694 | dil 1:200 |
| Alexa Fluor 488-conjugated antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11055 | dil 1:600 |
| Phalloidin-Tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma | P1951 | dil 1:200 |
| DAPI | Solarbio | C0060 | dil 1:20 |
| Name | 회사 | 카탈로그 번호 | 코멘트 |
| Extracellular solution | |||
| Leiboviz의 L-15 Medium | Life Technologies | 41300-039 | 1L 물에 1팩 |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | 10mM |
| Name | Company | 카탈로그 번호 | 코멘트 |
| 세포내 솔루션 | |||
| CsCl | 시그마 | 7647-17-8 | 140 mM |
| MgCl2 | Sigma | 7791-18-6 | 2 mM |
| EGTA | 시그마 | 67-42-5 | 10 밀리미터미터 |
| HEPES | 시그마 | 7365-45-9 | 10 |
| mMName | Company | 카탈로그 번호 | Comments |
| Equipment | |||
| Osmometer | Gonotec | OSMOMAT 3000 basic | |
| Forcep | WPI | 14095 | 핀셋 dumont |
| 마이크로 피펫 풀러 | 셔터 기기 | MODLE-P97 | |
| Micro Forge | Narishigen | MF-830 | |
| 미니 운영 체제 | 셔터 기기 | MP-285 | |
| MultiClamp | Axon | 700B | |
| 저잡음 데이터 수집 시스템 | Axon | 1440A | |
| ES1 발표자 | Tucker-Davis Technologies TDT 시스템, 3 Tucker-Davis Technologies | ||
| Name | Company | 카탈로그 번호 | Comments |
| Software | |||
| SigGenRP 소프트웨어 | Tucker-Davis Technologies | ||
| BioSigRP 소프트웨어 | Tucker-Davis Technologies | ||
| jClamp | Scientific Solutions | ||
| Name | Company | 카탈로그 번호 | Comments |
| Animal | |||
| 남부 의과 대학의 | SD 쥐 |
참고문헌
- He, D. Z., Zheng, J., Kalinec, F., Sacchi Kakehata, S. S. antos-, J, Tuning in to the amazing outer hair cell: membrane wizardry with a twist and shout. J Membr Biol. 209, 119-134 (2006).
- Dallos, P. Cochlear amplification, outer hair cells and prestin. Curr Opin N....
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재인쇄 및 허가
