꼬마 선 충 (C. 선 충) axonal 세포내 수송을 공부 하는 좋은 모델입니다. 여기, 내가 vivo에서 녹음 및 C. 선 충에 axonal intraflagellar 수송의 분석을 위한 프로토콜을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
Axonal 전송 및 intraflagellar 전송 (IFT) 축 삭과 속눈썹 morphogenesis 및 기능에 대 한 필수적입니다. Kinesin superfamily 단백질과 다 분자 모터를 각각 참가자 및 역행 전송 규제 있습니다. 이 모터는 레일으로 microtubule 네트워크를 사용합니다. 꼬마 선 충 (C. 선 충) axonal 전송 및 IFT에서 vivo에서공부 하는 강력한 모델 생물 이다. 나 axonal 교통과 IFT 생활에서 관찰 하는 프로토콜을 설명 하는 여기, C. 선 충. 수송된 화물 화물 단백질 같은 녹색 형광 단백질 (GFP) 형광 단백질을 사용 하 여 태그를 추가 하 여 구상 될 수 있다. C. 선 충 은 투명 하 고 GFP 태그 화물 단백질 세포 특정 발기인에서 특정 셀에 표현 될 수 있습니다. 살아있는 벌레 살인 또는 벌레를 마비 없이 10 %agarose 젤에 microbeads에 의해 해결할 수 있습니다. 이러한 조건 하에서 화물 움직임 관찰 될 수 있다 직접 축 삭 및 생활의 속눈썹에 절 개 없이 C. 선 충 . 이 메서드는 대상 단백질을 수정 하 여 셀 또는 셀에 표현에서 어떤 화물 분자의 관찰에 적용할 수 있습니다. 가장 기본적인 단백질 분자 모터 및 axonal 교통과 IFT에 관련 된 어댑터 단백질 C. 선 충에 보존 됩니다. 다른 모델 유기 체에 비해, 돌연변이 얻은 고 C. 선 충에 더 쉽게 유지. 이 메서드를 결합 하 여 다양 한 선 충 C. 돌연변이와 axonal 교통과 IFT의 분자 메커니즘 명확히 수 있습니다.
서론
라이브 셀 이미징 세포내 수송을 분석 하기 위한 필수적인 도구입니다. 신경 세포 생물학에서 라이브 셀 이미징 axonal 전송의 분석 신경 기능과 morphogenesis1를 이해 하기 위한 필수적입니다. 결함 axonal 전송에 여러 가지 신경 장애2기반이 됩니다. Kinesin superfamily 단백질과 다 수행 axonal 전송 anterogradely 그리고 retrogradely, 각각1,2.
속눈썹은 다른 세포질 격실 있는 microtubule 네트워크 및 밀매 기계는 고도로 발달된3. 단백질 종합 기계 하지 속눈썹 팁 속눈썹 단백질 세포질에서 수송 되어야 한다 즉, 속눈썹에 지역화 됩니다. 속눈썹 전용 kinesin 다, 라는 각각 kinesin-2와 세포질 다-2, 속눈썹4, intraflagellar 전송 (IFT)5라는 현상의 구성 요소를 전송. IFT의 장애 ciliopathies
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프로토콜
1. 샘플 준비
- 생성 유전자 변형 C. 선 충 유전자 변형 방법론 18를 사용 하 여 관심사의 변형. 또는, 적절 한 긴장을 꼬마 유전학 센터 (CGC)에서 가져옵니다. 시 냅 스 소포 선구자의 axonal 전송을 시각화 하려면 유전자 변형 라인 wyIs251 [Pmig-13::gfp::rab-3] 7. IFT 관찰, 유전자 변형 라인 mnIs17 [osm 6::gfp] 19를 얻을. 이러한 긴장은이 프로토콜에 사용 됩니다.
참고: 중 extrachromosomal 배열, 게놈 통합, 또는 심지어 GFP 노크에 작품. 배경 신호를 줄이기 위해, 사용 하 여 셀 특정 발기인 보다는 팬-신경 발기인.
참고: 벌레의 유지 관리는 다른 프로토콜 20에 설명 되어 있습니다. 변종 선 충 류 성장에 Escherischia 대장균 OP50 급지대의 잔디밭에 유지 되었다 중간 (NGM) 접시 (1.7% (w/v) agarose, 50 mM NaCl, 0.25% (w/v) 펩,....
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결과
DA9 신경 axonal 전송
WyIs251 선, 참가자 및 GFP::RAB-3의 역행 axonal 수송을 사용 하 여 DA9 모터 신경에 동시에 기록 될 수 있습니다. 참가자 및 역행 DA9 신경 근 등 축 삭에서의 평균 속도 약 1.8, 2.6 μ m/s, 각각22. 움직이는 소포 수 0.03 μ s 당 축 삭의 당 0.018에 대 한 것입니다. 따라서, 100 x 렌즈를 사용 하 여 DA9 축 삭의 10 μ m의 30 s 관찰, 대 한 한 약 9와 5 축 삭 (그림 4 및 영화 1)에서 소포를 이동 찾을 수 있습니다. 기공을 운동 관찰 될 수 있다, 레이저 힘은 너무 약이 가능 하다. 긴 범위 실행, 뿐만 아니라 소포 풀의 단거리 움직임 수 (영화 1)를 기록.......
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토론
기존의 방법에 관하여 제한
여기 설명 하는 방법은 관찰 axonal 전송 등 IFT 빠른 이벤트 최적화 됩니다. 따라서, 동원 정지는 더 이상 부 화 보다 우선 됩니다. 우리는 중요 한 섭 동 없이 적어도 20 분 동안 매매 이벤트를 관찰할 수 있다,이 방법은 않을 수 있습니다 항상 축 삭 신장 등 셀 마이그레이션 더 이상 관찰을 요구 하는 느린 이벤트를 관찰 하는 적당 한. 더 이상 관찰에 대 한 하나는 agarose의 비율을 감소 시켜 조건을 최적화 해야 (즉, 증가 하 고 최대 건조 하 고 그 잠재적으로 압력 감소를 피하기 위해 물을 발생 하는 손상). 또는,15 또는 immobilization 웜 agarose 패드와 마 취를 사용 하 여 위에서 설명한 미세 장치 부작용을 신중 하 게 평가 해야 하는 동안 더 적합 한16 수 있습니다.
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공개 사항
저자는 공개 상관이 있다.
감사의 글
깊이 저자 박사 아 사코 스 기 모토 (도호쿠 대학) 그녀의 도움이 토론 감사합니다. wyIs251 박사 강 쉔 (스탠포드 대학)에서 관대 한 선물 했다. mnIs17 는 NIH 연구 인프라 프로그램 (P40 OD010440)의 사무실에 의해 자금 CGC에 의해 제공 했다. 이 작품은 JSP KAKENHI 그랜트 #17 H 05010 및 #16 H 06536와 다이 이치 산 쿄 재단, 뇌 과학 재단과 나이토 재단에 의해 지원 되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 슬라이드 유리(76 x 26mm) | Matsunami | S1111 | |
| 커버유리(22 x 40mm) | Matsunami | C024401 | |
| Agarose | Wako | 318-01195 | |
| Polystylene 마이크로비즈 0.1 미크론 | Polysciences | #00876 | |
| 열 블록 | TAITEC | 0063288-000 | CTU-mini |
| 현미경 | Olympus | IX-71 | 와이드 필드 현미경 |
| 회전 디스크 스캐너 | Yokogawa | CSU-X1 | 회전 디스크 컨포칼 스캐너 |
| 디지털 CCD 카메라 | Hamamatsu Photonics | C10600-10B | ORCA-R2 디지털 CCD 카메라 |
| 대물 렌즈 (x100, NA1.4) | Olympus | UPLSAPO 100XO | |
| 파스퇴르 피펫 (5 인치) | IWAKI | IK-PAS-5P | |
| 유리관 (직경 1.5cm x 10.5cm) | IWAKI | 9820TST15-105NP | |
| TV9211 : wyIs251 | Laboratory of Kang Shen | N/A | |
| OTL11: mnIs17 | Ref. 27, 29 | N/A | SP2101은 6번 와일드 타입으로 역교배되었습니다 |
| . 실체 현미경 | Carl Zeiss | 435064-9000-000 | STEMI 508 |
| 미러 투과 조명 유닛 | Carl Zeiss | 435425-9010-000 | |
| 백금 와이어 (0.2 mm) | Nilaco Corporation | m78483501 | |
| 60 mm 플라스틱 접시 | Falcon | #351007 | |
| Fiji | N/A | N/A | |
| 선충 성장 매체 (NGM) | 1.7% (w/v) 아가로스, 50mM NaCl, 0.25% (w/v) 펩톤, 1 mM CaCl2, 5 mg/mL 콜레스테롤, 25 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4 |
참고문헌
- Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease. Neuron. 68 (4), 610-638 (2010).
- Holzbaur, E. L., Scherer, S. S. Microtubules, axonal transport, and neuropathy. N En....
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재인쇄 및 허가
