지리적 위축의 눈이 큰 모델에 인간 배아 줄기 세포 유래 망막 색소 상피 세포의 subretinal 이식

요약

망막 색소 상피 세포 건조 연령 관련 황 반 변성의 고급 형태에 대 한 세포 보충 치료 될 수 있습니다. 이 프로토콜 지리적 위축의 눈이 큰 모델 및 질병의이 모델에 인간 배아 줄기 세포 유래 망막 색소 상피 세포의 subretinal 이식의 생성을 설명합니다.

초록

지리적 위축 (GA), 건조 연령 관련 황 반 변성의 늦은 단계는 망막 안료 상피 (RPE) 계층, 중요 한 망막 구조 (예를 들면, 대뇌)의 후속 퇴보로 연결의 손실에 의해 특징은 발생 심한 시력 장애입니다. 마찬가지로, RPE 손실 및 시력 감소는에서 보인다 장기 따라 최대 intravitreal 항 혈관 내 피 성장 인자 (VEGF) 치료를 받고 고급 젖은 연령 관련 황 반 변성 (AMD)과 환자의. 따라서, 한편으로, 그것은 근본적인 RPE 세포 대체 요법으로 사용할 수 있는 무제한 소스에서 효율적으로 파생. 다른 한편으로, 동작 및 질병 반하는의 모델에서 파생 된 셀의 통합 수술을 평가 하는 것이 중요 하다 고 이미징 방법으로 인 간에 적용 된 수로 닫습니다. 여기, 우리 제공 조지아의 전 임상 모델의 생성을 설명 하는 우리의 이전 간행물에 따라 상세한 프로토콜 흰둥이 토끼 눈을 사용 하 여 인간 배아 줄기 세포의 평가 파생 된 망막 색소 상피 세포 (hESC-RPE) 대에 임상 관련 설정입니다. 차별화 된 hESC RPE는 순진한 눈 또는 NaIO₃눈에 이식-25 G transvitreal 동위 플 기술을 사용 하 여가 같은 망막 변성을 유도. 퇴 화와 이식 분야의 평가 복합 고해상도 비-침략 적 실시간 이미징에 의해 수행 됩니다.

서론

이 프로토콜 subretinal 공간에 이식된 hESC RPE의 통합의 평가 허용 하는 지리적 위축 (GA)의 큰 눈이 전 임상 모델의 생성을 설명 합니다. 여기에 설명 된 방법은 hESC¹, 외부 망막 손상 및 GA 같은 표현 형의 창조에서 RPE 세포의 풍부한, 순수, 고 기능 인구 생산을 보여 주는 3 최근 출판물에 사용 된 생리 소금 솔루션 (즉, BSS와 PBS) 또는 토끼 눈^2,3NaIO₃ 의 subretinal 주입에 의해 유도. 우리 hESC RPE의 하위 망막 정지 이식 포토 리셉터 구조 용량²광범위 한 기능 monolayers 형태로 입증 되었습니다.

몇 가지 장점이 동반 질병의 조지아 모델의 생성에 대 한 토끼 눈의 사용. 첫째, 크기 토끼 눈의 70%는 성인 인간의 눈의 볼륨은, 일상적으로 사용 하는 작은 설치류 눈 (1000 셀 / µ L 대 50, 000 셀 / µ L)⁴ 보다 훨씬 낮은 세포 밀도 사용 하 여 임상적으로 의미 있는 이식 수 ^{, 5}. 둘째, 설치류에 수술은 일반적으로 맥락 막의, 망막 장벽을 타협 하 고 잠재적으로 염증 반응과 가능한 거부⁶을 통해 transscleral. 두 요소는 함께 multilayering와 이식된 세포와 방해 네이티브 망막 조직에 이식된 세포의 전반적인 가난한 통합의 응집을 발생할 수 있습니다. 그러나, 큰 눈 토끼 모델 계측 임상 설정으로 동일과 수술 기법을 수행할 수 있습니다. 셋째, 눈이 큰 모델도 고해상도 허용 vivo에서 이미징 및 이식된 세포와 시간^1,2,3overlying 망막의 모니터링 합니다. 따라서, 우리는 정상 및 병에 걸리는 망막과 망막 하 공간의 연구에 관심을 가진 사람에 대 한 설치류에 매력적인 대안이 되어야 임상적으로 적절 하 고 비용 효율적인 전 임상 모델을 설명 합니다.

프로토콜

다음 프로토콜 카롤 린스 카 Instituet의 동물 보호 지침을 따릅니다. 뉴질랜드 백 변종 토끼 (자료 테이블)를 사용 하 여 모든 동물 실험 지역 동물 윤리 위원회 (Stockholms Norra Djurförsöksetiska Nämnd)에 의해 승인 되었습니다 (허용: dnr 56/15). HESC (dnr 2011/745-31/3)의 사용 및 전송 hESC RPE (dnr 2013/813-31/2)의 조작 또한 스웨덴 입법 및 카롤 린스 카 Institutet 규정 이며 지역 인간의 윤리 위원회 (에 의해 승인 되었습니다. Regionala Etikprövningsnämnden 나 스톡홀름).

1. subretinal 주입 나트륨 요오드 산 염 (NaIO₃) 눈 큰 동물 모델

1. 동물 마 취 제 35 mg/kg의 혼합물으로 허벅지에 근육 관리와 30 G 주사기를 사용 하 여 식 염 수에 5 mg/kg xylazine anesthetize 그리고 0.75 %cyclopentolate 및 2.5 %phenylephrine 혼합 사용 안 하는 국 소 약으로 학생 같은데요. 적절 한 anesthetization 확인 동물 그것의 뒤 다리의 하드 핀치에 반응 하지 않는 경우.
2. 외과 의사 (그림 1A)를 직면 하 고 머리와 수술 현미경 토끼를 놓습니다. 뚜껑 견인을 사용 하 여 오염 위험을 최소화 하기 위해 살 균 헝겊으로 눈 꺼 풀과 nictitans 멤브레인을 제거. 사용 소금 솔루션 (BSS) 양쪽 눈에 마 취에서 건조를 방지 하기 위해 균형.
3. 미세, 2 포트 사용 (또는 옵션 3-포트)에 대 한 25 G transvitreal는 플 기술 microsurgical 악기 (그림 1B)의 삽입에 대 한 비 밸브 trocars와 함께 갈 거 예요. 다기능 vitrectomy 기계는 주입 정, endoillumination, vitrector, 및 endolaser를 연결 하는 포트. Subretinal 주사만 endoillumination은 필수, 2-포트 설정을 충분 하 게 하. 상단 왼쪽된 trocar를 통해는 endoillumation를 삽입 하 고 위 오른쪽 trocar subretinal 주입 정에 대 한 사용.
   1. 3-포트 설정에 대 한 BSS 주입 정에 대 한 낮은 임시 trocar를 사용 합니다. 경우 (예: vitrector) 옵션 악기는 상단 오른쪽 trocar를 통해 그들을 삽입, 사용.
   2. Limbus를 잡아 삽입 사이트 overlying 결 치환 발톱된 집게를 사용 하 여에서 위 2 trocars 1-2 m m를 삽입 합니다.
   3. trocars는 30-45 ° 각도로 limbus 병렬, 삽입 된 transsclerally는 그리고는 trocar 끝의 중간 다는 것을 확인 하십시오. 다음 trocar 90 °를 돌아서 눈의 후부 극에 눈으로 미리. 이 절차는 sclerotomies에서 수술 후 누설을 방지 하 고 또한 endophthalmitis (즉, 눈에 세균 감염)의 위험을 감소. Trocar 위치 또한 그림 2B 참조.
   4. 눈과 콘택트 렌즈 (그림 1A) 사이의 연락처 젤으로 합성 눈물으로 망막을 시각화 하기 위해 각 막에 단일 사용 평면 콘택트 렌즈를 넣어.
   5. 확장 튜브 (도우미 운영)에 연결 된 1 mL 주사기와 38 G polytip 정 (외과 의사에 의해 운영)으로 NaIO₃ 의 500 µ L를 그립니다.
   6. 상단 왼쪽된 trocar 통해 endoillumination 프로브와 상단 오른쪽 trocar 통해 주입 정을 삽입 하 고 망막, 시 신경 머리 바로 아래 지역에 대 한 목표로 향해 유리 공간을 통해 정 미리.
   7. 정 초점 화이트닝 표시 될 때까지 천천히 망막을 터치의 팁을 수 있습니다. 자체 사출 subretinal 납품을 허용 하는 망막에 침투 합니다. 이 출혈 될 수 있으므로 망막, 관통 정 맥을 하지 마십시오.
   8. 5 s 동안 subretinally NaIO₃ 의 50 µ L를 주사. 기본 맥락 막과 망막 사이 자연 분열 비행기 때문에, 명확 하 게 보이는 반투명 bleb 주사 동안 점차적으로 형성 한다.
   9. 주입, 동안 천천히 바늘을, 철회 하지만 팁 역류를 최소화 하기 위해 bleb 내에서 유지 됩니다.
   10. Endoillumation 및 주입 정 맥의 제거 후, 발톱된 집게를 사용 하 여 trocars를 제거 하 고 30에 대 한 가벼운 압력 끝 이나는 집게의 무뚝뚝한 끝을 사용 하 여 자체 봉인 봉합 덜 sclerotomies s.
4. Post-surgically 10 mL 피하 탈수를 방지 하기 위해 염 분을 제공 합니다. 수술 후 국 소 스테로이드 나 항생제를 주지 않는다. 진통제에 대 한 수술 후 하루 buprenorphine 0.3 mg/ml 피하 후 수술의 0.5 mL를 제공 합니다.
5. 사용 후, 그들 immersing 몇 초에 대 한 첫째 70% 에탄올에 둘째 45% 에탄올에 의해 모든 악기를 세척 하 고 마지막으로에 증류수. 제대로 종이 수건으로 그들을 건조.
6. 그들은 충분 한의 식을 회복 하 고 모든 단일 encaged 배치 될 때까지 동물을 참석. (예를 들어, immunohistochemistry 목적을 위해) 필요한 경우 100 mg/kg pentobarbital에의 정 맥 주입 하 여 동물을 안락사 ( 재료의 표참조).
7. HESC RPE 세포의 이식으로 진행 7 일 기다립니다.

2. subretinal 이식 치료 동물에서 hESC RPE 세포의

1. 삽입 1-2 m m 낮은 임시 사분면 limbus에서 hESC RPE의 이식 하기 전에 1 주 30 g 주사 바늘을 사용 하 여 마 취 동물에 intravitreal triamcinolone의 2 mg (100 µ L)를 관리 하 고 다시 3 개월 마다 그것을 관리. 렌즈 터치를 피하기 위해 눈의 후부 극으로 팁을 가리키고 있는지 확인 합니다.
2. 앞에서 설명한¹hESC RPE 단층 문화.
3. 셀 차별화 ( 재료의 표참조)의 미디어 24 잘 confluent hESC RPE 단층을 제거 하 고 각을 세척 없이 캘리포니아^{2 +} 그리고 마그네슘^{2 +}PBS의 500 µ L로 잘. 2 세척의 총에 대 한이 작업을 한 번 더 반복 합니다.
4. 상쾌한 삭제, 잘, 당 trypsin의 500 µ L을 추가 하 고 37 ° c.에 12 분 동안 품 어
5. 접시를 기울기와 트립 신 (셀 플레이트에 연결 된 남아 있어야 한다)를 조심 스럽게 제거. 부드러운 pipetting, 또는 심지어 필요한 경우, 단일 세포 현 탁 액을 얻기 위해 근 근이 살아가고에 의해 신선한 37 ° C prewarmed 차별화 미디어의 800 µ L에서 세포를 수집 합니다.
   참고: 셀 덩어리는 관찰 하는 경우 40 µ m 셀 스 트레이너를 사용 합니다.
6. 0.2%를 사용 하 여 hemocytometer 챔버에 Count 셀 Trypan 블루, 제조업체의 지침에 따라.
7. 실 온에서 차별화 미디어와 원심 분리기 세포, 5 분 300g x 5 mL를 추가 합니다.
8. 상쾌한 무시 하 고 갓 필터 소독 PBS (25 m m 주사기 필터를 통해 전달) 1, 000 셀 / µ L의 최종 농도에 있는 펠 릿 resuspend.
9. 약 수 600 µ L aliquots와 얼음까지 하 고 수술 하는 동안에 계속 이전 세포 현 탁 액.
10. 30 G 주사기를 사용 하 여 염 분 35 mg/kg 케 타 민 및 5 mg/kg xylazine의 혼합물으로 허벅지에 근육 관리 하 여 동물을 anesthetize. 0.75 %cyclopentolate 및 2.5 %phenylephrine amix 사용 안 하는 국 소 약으로 눈동자를 같은데요. 적절 한 anesthetization 확인 동물 그것의 뒤 다리에 하드 핀치에 반응 하지 않는 경우.
11. 외과 의사를 직면 하 고 머리와 토끼를 놓습니다. 뚜껑 견인을 사용 하 여 오염 위험을 최소화 하기 위해 살 균 헝겊으로 눈 꺼 풀과 nictitans 멤브레인을 제거. BSS를 사용 하 여 양쪽 눈에 마 취에서 건조를 방지 하기 위해.
12. 미세, 2 포트 사용 (또는 옵션 3-포트)에 대 한 25 G transvitreal는 플 기술 단계 1.3과 그림 2에 설명 된 대로 동일한 위치에 배치 하는 trocars와 함께 갈 거 예요. 이전 sclerotomies 표시 되는 경우 단지 인접 trocar 삽입을 수행 하지만 하지 이들을 통해, 수술 후 누설의 위험을 최소화 하기 위해.
    1. 눈과 콘택트 렌즈 (그림 1A) 사이의 연락처 젤으로 합성 눈물으로 망막을 시각화 하기 위해 각 막에 단일 사용 평면 콘택트 렌즈를 넣어.
    2. 적절 한 팁 (참조 단계 1.3.5 1.3.6) 위치, 후 부드럽게 혼합 hESC RPE 정지 (50000 셀)의 50 µ L를 subretinally 주사. NaIO₃ 청소용된 지역 특성 "금속" 엔도 조명 반사에 의해 구별의 센터에 대 한 목표. Neurosensory 망막 명확 하 게 보이는 bleb을 만들기 쉽게 구분 해야 합니다. 플러시 바늘 때문에 셀 막힘을 피하기 위해 사용 토끼/후 살 균 H₂O 사이 바늘을 묶습니다. 변경 바늘 막힘 때 것으로 나타났습니다.
    3. 주입, 동안 천천히 바늘을 취소 하지만 팁 역류를 최소화 하기 위해 bleb 내에서 유지 됩니다.
    4. Endoillumation 및 주입 정 맥의 제거 후, 발톱된 집게를 사용 하 여 trocars를 제거 하 고 30에 대 한 가벼운 압력 끝 이나는 집게의 무뚝뚝한 끝을 사용 하 여 자체 봉인 봉합 덜 sclerotomies s.
13. Post-surgically 10 mL 피하 탈수를 방지 하기 위해 염 분을 제공 합니다. 수술 후 국 소 스테로이드 나 항생제를 주지 않는다. 진통제에 대 한 수술 후 하루 buprenorphine 0.3 mg/ml 피하 후 수술의 0.5 mL를 제공 합니다.
14. 사용 후, 그들 immersing 몇 초, 첫째로 70% 에탄올에 둘째 45% 에탄올에 의해 모든 악기를 세척 하 고 마지막으로에 증류수. 제대로 종이 수건으로 그들을 건조.
15. 그들은 충분 한의 식을 회복 하 고 모든 단일 encaged 배치 될 때까지 동물을 참석. (예: immunohistochemistry 목적), 필요한 경우 100 mg/kg pentobarbital에의 정 맥 주입 하 여 동물을 안락사.

3. Vivo에서 망막 및 Subretinal 이미징

1. 함께 제공 된 소프트웨어와 스펙트럼 도메인 광학 일관성 단층 촬영 (SD-10 월) 장치를 사용 하 여 (재료의 표 참조)를 제조업체의 지침에 따라 치료 동물의 횡단면 b-스캔. 이미지 흐림 방지, 매 30-60 s 국 소 염 분으로 홍 조에 의해 각 막 촉촉한을 유지 해야 합니다.
   1. 마 취 및 눈동자 크기 동물 (단계 1.1 및 2.10 참조)를 가리지 경로에서 악기 광원 토끼 망막에 조정 산에 놓습니다.
   2. 3 10 월 스캔 동시 적외선 공초점 레이저 스캐닝 레이저 ophthalmoscopy (IR-cSLO) 반사율 참조 이미지 삽입 된 영역의 상단, 중앙, 및 더 낮은 부분을 나타내는 얻을.
   3. CSLO 블루와 en 얼굴 저 이미지를 얻을, 녹색, 적외선, 그리고 다 색 레이저 반사율 (즉, 여러 개의 동시 레이저 색상), 각각.
   4. SD-10 월 장치의 블루 빛 레이저 기능을 사용 하 여 블루 라이트 autofluorescence (BAF) 이미지를 캡처하십시오.

결과

BAF, IR-cSLO, 및 정상적인 흰둥이 토끼 망막의 SD-10 월의 대표 vivo에서 이미지 그림 2에 표시 됩니다. 빛의 반사 SD 10 월 악기에 의해 점령의 그들의 독특한 레벨 다른 망막 층 note

그림 1A , 그림 1B하위 망막 blebs 만들려면 설치 설명 된다: 쓰는 렌즈를 피하기 위하여 3 trocars (그림 1B) limbus까지 1-2 m m의 삽입을 허용 하도록 눈 뚜껑으로 뚜껑 견인 위치 터치, 그리고 30-45 ˚ limbus 병렬 각도에서. Trocars는 선택적 주입 정 빛, 및 공 막 엔 통해 주사 ...

토론

이 프로토콜에서 hESC RPE 통합에서 vivo에서 평가 대 한 조지아와 그것의 임상 사용의 눈이 큰 모델의 생성을 설명 합니다.

번역에 대 한 재생 치료의 조지아 및 관련된 질병에 대 한 클리닉⁷에, 그것은 개발 하 고 충실 하 게 이식 및 이미징에 대 한 임상 메서드를 캡처하는 방법을 최적화 하는 것이 중요. 매력적인이 측면에서 토끼가: 비교적 큰 눈 안 구내 수술 및 표준 이미징의 사용을 허용 하 고 저렴 하 고 쉽게 지 내게 다른 눈이 큰 동물에 비해입니다.

우리는 하위 망막 blebs 하위 망막 손상을 유발 하거나 이식 hESC RPE의 창조에 대 한 표준 transvitreal 25 게이지 동위 플 vitrectomy 기술의 사용을 설명 합니다. 그림 1B에 나와 있는 경우는 vitrectomy 절차 동안 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
NutriStem hESC XF 분화 배지 – bFGF 및 – TGFb	Biological Industries	06-5100-01-1A
TrypLE Select 1x	Gibco, ThermoFisher Scientific Corp	12563-011
PBS without Ca2+ and Mg2+	Gibco, ThermoFisher Scientific Corp	14190-094
Cell strainer 40 μ m 나일론	VWR	732-2757
바늘 30 G 0.5' ’; 0.3mm x 13mm	BD Microlance	304827
Acrodisc 25mm 주사기 필터	Acrodisc	PN4612
0.4% 트리판 블루	ThermoFisher Scientific Corp	15250061	0.2%
NaIO에서 사용 3	Sigma-Aldrich Corp	S4007
BSS	Alcon Nordic A/S	65079550
70% 에탄올	Solveco AB	1047
케타미놀, 100mg/mL	인터벳, Boxmeer	511519	35mg/kg 케타민
Rompun 수의사, 20mg/mL	Bayer Animal Health	22545	5mg/kg 자일라진
트리에스센스 사용, 40mg/mL	Alcon Nordic A/S		412915 2mg 유리체내
사이클로펜톨라트-페닐에프린, 0.75% + 2.5%	APL	321968	각 눈에
Viscotears	Laboratoires Thé 597562
국소 식염수	Apotea AB	7053249369080
Allfatal vet. 100 mg/mL	Omnidea	77168	100 mg/mL 펜토바르비탈
확장 튜브 사용(해머)	MedOne Surgical Inc	3223
25 G/38 G 폴리팁 망막하 캐뉼라	MedOne Surgical Inc	3219	25 G/38 G
일회용 평면 렌즈	Volk
Barraquer Colibri 뚜껑 견인	AgnTho's AB	42-020-030
밸브가 없는 투관침	Alcon Nordic A/S	8065751448
발톱 집게 집게	Bausch & Lomb Nordic AB	ET1811
Alcon Accurus 400VS 유리체 절제술 기계	Alcon Nordic A/S	8065740238
Accurus 25+ 게이지 유리체 절제술 TotalL Plus Pak	Alcon Nordic A/S	8065751493
SD-OCT 장치	하이델베르크 엔지니어링	Spectralis HRA+OCT	하이델베르크 아이 익스플로러 버전 1.9.10.0
사용 24웰 플레이트	Sarstedt	83.3922
Neubauer 혈구계	VWR	631-0925
뉴질랜드 알비노 토끼	Lidkö pings Rabbit Farm, Sweden
hESC-RPE 세포			참조 번호 참조 1
Buprenodale Vet, 0.3 mg/ml	Dechra	660500	0.5 mL 부프레노르핀 피하 사용