Sous-rétinienne Transplantation de cellules souches embryonnaires humaines pigmentaires rétiniennes dérivées de cellules épithéliales dans un modèle grand aux yeux de l’atrophie géographique
Summary
Cellules épithéliales pigmentaire rétinien pouvaient constituer une thérapie cellulaire-remplacement de la forme avancée de la dégénérescence maculaire sèche liée à l’âge. Ce protocole décrit la génération d’un modèle grand aux yeux de l’atrophie géographique et la sous-rétinienne transplantation de cellules épithéliales pigmentaire rétinien dérivé de cellules souches embryonnaires humaines dans ce modèle de la maladie.
Abstract
L’atrophie géographique (GA), le dernier stade de la dégénérescence maculaire liée à l’âge sèche se caractérise par la perte de la couche pigmentaire rétinien épithéliale (RPE), qui mène à la dégénérescence ultérieure des structures rétiniennes vitales (par exemple, photorécepteurs) causant déficience visuelle grave. De même, pre-perte et diminution de l’acuité visuelle est vu dans suivre à long terme jusqu’à des diabétiques avancée liées à l’âge dégénérescence maculaire humide (AMD) recevant un traitement anti-vasculaire facteur de croissance endothéliale (VEGF) intravitréenne. Par conséquent, d’une part, il est fondamental pour calculer efficacement les cellules RPE provenant d’une source illimitée qui pourrait servir de traitement substitutif. En revanche, il est important d’évaluer le comportement et l’intégration des cellules dérivées d’un modèle de la maladie entraînant chirurgicale et des méthodes d’imagerie comme près que possible de celles appliquées dans les humains. Ici, nous fournissons un protocole détaillé basé sur nos publications antérieures qui décrit la génération d’un modèle préclinique de l’Assemblée générale à l’aide de le œil de lapin albinos, pour évaluer les cellules souches embryonnaires humaines dérivées des cellules épithéliales pigmentaire rétinien (CSEh-RPE) dans un paramètre cliniquement pertinente. PRE-CSEh différenciée sont transplantées yeux naïfs ou les yeux NaIO3-induite de GA-comme la dégénérescence rétinienne à l’aide d’une technique 25 G transvitreal pars plana. Évaluation des zones dégénérées et transplantés est réalisée par imagerie en temps réel non invasif multimodale à haute résolution.
Introduction
Ce protocole décrit la génération d’un modèle préclinique grand aux yeux de l’atrophie géographique (GA) qui permet l’évaluation de l’intégration de CSEh-RPE transplanté dans l’espace sous-rétinienne. Les méthodes décrites en détail ici ont été utilisés dans les 3 publications récentes qui démontrent la production d’une population enrichie, pure et fonctionnelle des cellules RPE de CSEh1, ainsi que la création de dommages rétiniens externe et un phénotype de type GA induite par l’injection sous-rétinienne de solutions salines et physiologiques (c.-à-d., BSS et PBS) ou NaIO3 dans le lapin yeux2,3. De plus, nous avons démontré que greffes de suspension sous rétinien de CSEh-RPE forment une vaste monocouches fonctionnelles avec photorécepteur sauvetage capacité2.
Plusieurs avantages accompagnent l’utilisation de le œil du lapin pour la génération d’un modèle de GA de la maladie. Tout d’abord, la taille de le œil du lapin, qui est de 70 % le volume d’un œil humain adult, permet cliniquement significative transplantation en utilisant une densité cellulaire qui est beaucoup plus faible que couramment utilisés dans les petits yeux rongeur (1 000 cellules/µL par rapport à 50 000 cellules/µL)4 , 5. Deuxièmement, la chirurgie chez les rongeurs est généralement transscleral par le biais de la choroïde, qui compromet la barrière rétinienne et potentiellement déclenche une réaction inflammatoire et un éventuel rejet6. Ensemble, les deux facteurs peuvent conduire à multicouches et agglutination des cellules transplantées et une intégration dans l’ensemble pauvre des cellules transplantées dans un tissu rétinien natif perturbé. Toutefois, le modèle de lapin aux grands yeux permet de réaliser une technique chirurgicale avec instrumentation identique au milieu clinique. Troisièmement, un modèle aux grands yeux permet également à haute résolution in vivo d’imagerie et de surveillance des cellules transplantées et la rétine sus-jacente à temps1,2,3. Ainsi, les auteurs décrivent un modèle préclinique cliniquement pertinent et rentables qui devrait être une alternative intéressante aux rongeurs pour tous ceux qui s’intéressent à la recherche de la rétine normale et malade et l’espace sous rétinien.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans ce protocole, la génération d’un modèle aux grands yeux de GA et son usage préclinique pour évaluer les CSEh-RPE integration in vivo est décrite.
Pour la traduction de thérapies régénératives pour GA et les maladies apparentées dans la clinique7, il est important de développer et d’optimiser des méthodes qui capturent fidèlement les méthodes cliniques de transplantation et d’imagerie. Le lapin est dans cet aspect attrayant : il a un ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été financée par des subventions de l’Institut Karolinska, Fondation de la princesse héritière Margareta pour déficients visuels, la Edwin Jordanie Fondation pour la recherche ophtalmologique, la Fondation suédoise de le œil, le roi Gustav V Foundation, le ARMEC Lindeberg Foundation et la Fondation Cronqvist.
Materials
| NutriStem hESC XF differentiation medium –bFGF and –TGFb | Biological Industries | 06-5100-01-1A | |
| TrypLE Select 1x | Gibco, ThermoFisher Scientific Corp | 12563-011 | |
| PBS without Ca2+ and Mg2+ | Gibco, ThermoFisher Scientific Corp | 14190-094 | |
| Cell strainer 40 μm Nylon | VWR | 732-2757 | |
| Needle 30g 0.5’’; 0.3 x 13mm | BD Microlance | 304827 | |
| Acrodisc 25mm Syringe Filter | Acrodisc | PN4612 | |
| 0.4 % trypan blue | ThermoFisher Scientific Corp | 15250061 | Use at 0.2% |
| NaIO3 | Sigma-Aldrich Corp | S4007 | |
| BSS | Alcon Nordic A/S | 65079550 | |
| 70% Ethanol | Solveco AB | 1047 | |
| Ketaminol, 100 mg/mL | Intervet, Boxmeer | 511519 | Use 35 mg/kg ketamine |
| Rompun vet, 20 mg/mL | Bayer Animal Health | 22545 | Use 5 mg/kg xylazine |
| Triescence, 40 mg/mL | Alcon Nordic A/S | 412915 | 2 mg intraviterial |
| Cyklopentolat-phenylephrine, 0.75% + 2.5% | APL | 321968 | Use 1 drop in each eye |
| Viscotears | Laboratoires Théa | 597562 | |
| Topical saline | Apotea AB | 7053249369080 | |
| Allfatal vet. 100 mg/mL | Omnidea | 77168 | Use 100 mg/mL pentobarbital |
| Extension tube (Hammer) | MedOne Surgical Inc | 3223 | |
| 25G/38G polytip subretinal cannula | MedOne Surgical Inc | 3219 | 25G/38G |
| Single Use Flat Lens | Volk | #VWFD10 | |
| Barraquer Colibri lid retractor | AgnTho's AB | 42-020-030 | |
| Non-valved trocars | Alcon Nordic A/S | 8065751448 | |
| Clawed forceps | Bausch & Lomb Nordic AB | ET1811 | |
| Alcon Accurus 400VS Vitrectomy machine | Alcon Nordic A/S | 8065740238 | |
| Accurus 25+ Gauge Vitrectomy TotalL Plus Pak | Alcon Nordic A/S | 8065751493 | |
| SD-OCT device | Heidelberg Engineering | Spectralis HRA+OCT | Use Heidelberg Eye Explorer version 1.9.10.0 |
| 24 well plates | Sarstedt | 83.3922 | |
| Neubauer hemocytometer | VWR | 631-0925 | |
| New Zealand albino rabbits | Lidköpings Rabbit Farm, Sweden | ||
| hESC-RPE cells | See reference number 1 |
References
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