Subretinal transplantasjon av menneskelige embryonale stamcelleforskningen avledet retinal Pigment epitelceller i store øyne modell av geografiske Atrophy
Summary
Netthinnens pigment epitelceller kunne tjene som en erstatning for cellen terapi for avansert form av tørre aldersrelatert makuladegenerasjon. Denne protokollen beskriver generering av en stor-eyed modell av geografiske atrofi og subretinal transplantasjon av menneskelige embryonale Stamcelle-avledet netthinnens pigment epitelceller i denne modellen av sykdom.
Abstract
Geografiske atrofi (GA), sent stadium av tørr aldersrelatert makuladegenerasjon er preget av tap av netthinnens pigment epiteliale (RPE) laget, som fører til etterfølgende degenerasjon av vitale retinal strukturer (f.eks, fotoreseptorer) forårsaker alvorlig synshemming. Tilsvarende sett RPE-tap og reduksjon i synsskarphet i langsiktig følge opp av pasienter med avansert våt alder makuladegenerasjon (AMD) intravitreal anti-vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) behandling. Derfor, på den ene siden, er det grunnleggende å utlede effektivt RPE celler fra en ubegrenset kilde som kan tjene som erstatning terapi. På den annen side, er det viktig å vurdere atferden og integrering av avledede cellene i en modell av sykdom innebærer kirurgiske og tenkelig metoder som nær som mulig å brukes i mennesker. Her gir vi en detaljert protokoll basert på våre tidligere publikasjoner som beskriver generasjonen av prekliniske modell av GA bruker kaninøyne albino for evaluering av den menneskelige embryonale stamcelleforskningen avledet netthinnens pigment epitelceller (hESC-RPE) i en klinisk innstillingen. Differensierte hESC-RPE er transplanted inn i naiv øyne eller øyne med NaIO3-indusert GA-lignende retinal degenerasjon bruke en 25 G transvitreal pars plana teknikk. Evaluering av degenerert og transplantert utføres av flere høyoppløselige ikke-invasiv sanntid tenkelig.
Introduction
Denne protokollen beskriver generering av en stor-eyed prekliniske modell av geografiske atrofi (GA) som gjør evalueringen av integrering av transplantert hESC-RPE i feltet subretinal. Metodene som er beskrevet i detalj her har blitt brukt i 3 nye publikasjoner som viser produksjon av en beriket, rene og funksjonelle befolkning av RPE celler fra hESC1, samt etablering av ytre retinal skade og en GA-lignende fenotypen indusert av subretinal injeksjon av fysiologiske salt løsninger (i.e.BSS og PBS) eller NaIO3 i kanin øye2,3. Vi viste videre at sub retinal suspensjon transplantasjon av hESC-RPE danner omfattende funksjonelle monolayers med photoreceptor hjelpe kapasitet2.
Flere fordeler følge bruk av kanin øyet for generering av GA modell av sykdom. Først størrelsen på kaninen øyet, som er 70% volumet av en voksen menneskelige øye, kan klinisk meningsfull transplantasjon bruker en celle tetthet som er mye lavere enn rutinemessig brukes i små gnagere øyne (1000 celler/µL vs 50.000 celler/µL)4 , 5. deretter kirurgi i gnagere er vanligvis transscleral gjennom akkord, som kompromitterer retinal barrieren og potensielt utløser en inflammatorisk respons og en mulig avvisning6. Begge faktorer kan sammen føre til multilayering og klumper av transplantert celler, og en generell dårlig integrasjon av transplantert cellene i en forstyrret innfødt retinal vev. Store øyne kanin modellen kan imidlertid utføre en kirurgisk teknikk med instrumentering identisk med en klinisk setting. For det tredje, store øyne modell tillater også høy oppløsning i vivo avbildning og overvåking av transplantert cellene og overliggende netthinnen gjennom tid1,2,3. Således, beskriver vi en klinisk relevant og kostnadseffektiv prekliniske modell som skal være et attraktivt alternativ for gnagere for alle med en interesse i forskning av normal og syke netthinnen og sub retinal plass.
Protocol
Representative Results
Discussion
Generasjonen av en stor-eyed modell av GA og prekliniske bruk for å vurdere hESC-RPE integrasjon i vivo er beskrevet i denne protokollen.
For oversettelse av regenerativ Therapy for GA og sykdommer til klinikken7er det viktig å utvikle og optimalisere metoder som trofast fange de kliniske metodene for transplantasjon og bildebehandling. Kaninen er i dette aspektet attraktive: det har en relativt stor øye som tillater intraokulært kirurgi og bruk av standard…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien ble støttet av tilskudd fra Karolinska Institutet, Kronprinsesse Margareta grunnlaget for den synshemmede, Edwin Jordan grunnlaget for Ophthalmological forskning, svenske øye grunnlaget, Kong Gustav V Foundation, ARMEC Lindeberg Foundation, og Cronqvist Foundation.
Materials
| NutriStem hESC XF differentiation medium –bFGF and –TGFb | Biological Industries | 06-5100-01-1A | |
| TrypLE Select 1x | Gibco, ThermoFisher Scientific Corp | 12563-011 | |
| PBS without Ca2+ and Mg2+ | Gibco, ThermoFisher Scientific Corp | 14190-094 | |
| Cell strainer 40 μm Nylon | VWR | 732-2757 | |
| Needle 30g 0.5’’; 0.3 x 13mm | BD Microlance | 304827 | |
| Acrodisc 25mm Syringe Filter | Acrodisc | PN4612 | |
| 0.4 % trypan blue | ThermoFisher Scientific Corp | 15250061 | Use at 0.2% |
| NaIO3 | Sigma-Aldrich Corp | S4007 | |
| BSS | Alcon Nordic A/S | 65079550 | |
| 70% Ethanol | Solveco AB | 1047 | |
| Ketaminol, 100 mg/mL | Intervet, Boxmeer | 511519 | Use 35 mg/kg ketamine |
| Rompun vet, 20 mg/mL | Bayer Animal Health | 22545 | Use 5 mg/kg xylazine |
| Triescence, 40 mg/mL | Alcon Nordic A/S | 412915 | 2 mg intraviterial |
| Cyklopentolat-phenylephrine, 0.75% + 2.5% | APL | 321968 | Use 1 drop in each eye |
| Viscotears | Laboratoires Théa | 597562 | |
| Topical saline | Apotea AB | 7053249369080 | |
| Allfatal vet. 100 mg/mL | Omnidea | 77168 | Use 100 mg/mL pentobarbital |
| Extension tube (Hammer) | MedOne Surgical Inc | 3223 | |
| 25G/38G polytip subretinal cannula | MedOne Surgical Inc | 3219 | 25G/38G |
| Single Use Flat Lens | Volk | #VWFD10 | |
| Barraquer Colibri lid retractor | AgnTho's AB | 42-020-030 | |
| Non-valved trocars | Alcon Nordic A/S | 8065751448 | |
| Clawed forceps | Bausch & Lomb Nordic AB | ET1811 | |
| Alcon Accurus 400VS Vitrectomy machine | Alcon Nordic A/S | 8065740238 | |
| Accurus 25+ Gauge Vitrectomy TotalL Plus Pak | Alcon Nordic A/S | 8065751493 | |
| SD-OCT device | Heidelberg Engineering | Spectralis HRA+OCT | Use Heidelberg Eye Explorer version 1.9.10.0 |
| 24 well plates | Sarstedt | 83.3922 | |
| Neubauer hemocytometer | VWR | 631-0925 | |
| New Zealand albino rabbits | Lidköpings Rabbit Farm, Sweden | ||
| hESC-RPE cells | See reference number 1 |
References
- Plaza Reyes, A., et al. Xeno-Free and Defined Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells Functionally Integrate in a Large-Eyed Preclinical Model. Stem Cell Rep. 6 (1), 9-17 (2016).
- Bartuma, H., et al. In Vivo Imaging of Subretinal Bleb-Induced Outer Retinal Degeneration in the Rabbit. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (4), 2423-2430 (2015).
- Petrus-Reurer, S., et al. Integration of Subretinal Suspension Transplants of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells in a Large-Eyed Model of Geographic Atrophy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (2), 1314-1322 (2017).
- Carido, M., et al. Characterization of a mouse model with complete RPE loss and its use for RPE cell transplantation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (8), 5431-5444 (2014).
- Lund, R. D., et al. Human embryonic stem cell-derived cells rescue visual function in dystrophic RCS rats. Cloning Stem Cells. 8 (3), 189-199 (2006).
- Vugler, A., et al. Elucidating the phenomenon of HESC-derived RPE: anatomy of cell genesis, expansion and retinal transplantation. Exp Neurol. 214 (2), 347-361 (2008).
- Schwartz, S. D., et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).
- Hughes, A. A schematic eye for the rabbit. Vision Res. 12 (1), 123-138 (1972).
- Blanch, R. J., Ahmed, Z., Berry, M., Scott, R. A., Logan, A. Animal models of retinal injury. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (6), 2913-2920 (2012).
- Nork, T. M., et al. Functional and anatomic consequences of subretinal dosing in the cynomolgus macaque. Arch Ophthalmol. 130 (1), 65-75 (2012).
