Subretinal Transplantation av mänskliga embryonala stamceller härstammar-retinal Pigment epitelial celler till en stor-eyed modell av geografisk atrofi
Summary
Retinal pigment epitelial celler skulle kunna tjäna som en cell-substitutionsterapi för den avancerade formen av torra åldersrelaterad makuladegeneration. Det här protokollet beskriver generationen av en stor-eyed modell av geografisk atrofi och subretinal transplantation av mänskliga embryonala stamceller-derived retinal pigment epitelceller i denna modell av sjukdom.
Abstract
Geografisk atrofi (GA), sent skede av torra åldersrelaterad makuladegeneration kännetecknas av förlust av retinal pigment epitel (RPE) lagret, vilket leder till efterföljande degeneration av vitala retinal strukturer (t.ex., fotoreceptorer) orsakar svår synnedsättning. Likaså ses RPE-förlust och minskning av synskärpan i långsiktiga följer upp av patienter med avancerad våt åldersrelaterad makuladegeneration (AMD) som fick intravitreala anti vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF). Därför dels, är det grundläggande att effektivt härleda RPE-celler från en obegränsad källa som kan fungera som substitutionsterapi. Däremot, det är viktigt att bedöma om beteende och integrering av de härledda cellerna i en modell av den sjukdom som innebär kirurgisk och avbildningsmetoder som nära som möjligt till dem som tillämpas i människor. Här, vi ger ett detaljerat protokoll baserat på våra tidigare publikationer som beskriver generationen av en preklinisk modell av GA använda albino kanin ögat, för utvärdering av den mänskliga embryostamceller härrör retinal pigment epitelceller (hESC-RPE) i en kliniskt relevanta inställningen. Differentierade hESC-RPE transplanteras in i naiva ögon eller ögon med NaIO3-inducerad GA-liknande retinal degeneration med 25 G transvitreal pars plana teknik. Utvärdering av degenererade och transplanterade områden utförs av multimodal högupplösta noninvasiv realtid avbildning.
Introduction
Det här protokollet beskriver generationen av en stor-eyed preklinisk modell av geografisk atrofi (GA) som möjliggör utvärdering av integration av transplanterade hESC-RPE i subretinalområdet. De metoder som beskrivs här har använts i 3 senaste publikationer som visar tillverkning av en berikad, ren och funktionell befolkning av RPE-celler från hESC1, samt skapandet av yttre skada på näthinnan och en GA-liknande fenotyp induceras av subretinal injektion av fysiologiska saltlösningar (dvs, BSS och PBS) eller NaIO3 i rabbit eye2,3. Vi visade vidare att sub retinal suspension transplantationer av hESC-RPE bildar omfattande funktionella enskiktslager med ljusmätare rädda kapacitet2.
Flera fördelar åtföljer användningen av kanin ögat för generering av en GA modell av sjukdom. För det första storleken av kanin ögat, som är 70% av en vuxen mänskliga ögat, kan kliniskt transplantation med hjälp av en cell densiteten som är mycket lägre än rutinmässigt används i små gnagare ögon (1 000 celler/µL vs. 50.000 celler/µL)4 , 5. för det andra, kirurgi hos gnagare är oftast transskleral genom åderhinnan, som äventyrar den retinal barriären och potentiellt utlöser en inflammatorisk reaktion och ett möjligt förkastande6. Både faktorer kan tillsammans leda till multilayering och klumpar av transplanterade celler och en allmänt dåliga integration av de transplanterade cellerna i en störd infödda retinala vävnaden. Stor-eyed kanin modellen tillåter dock utföra en kirurgisk teknik med instrumentering identisk klinisk miljö. För det tredje, en stor-eyed modell också tillåter högupplösta i vivo imaging och övervakning av de transplanterade cellerna och överliggande näthinnan genom tid1,2,3. Således beskriver vi en kliniskt relevanta och kostnadseffektiva preklinisk modell som bör vara ett attraktivt alternativ till gnagare för alla med intresse för forskning av normala och sjuka näthinnan och sub retinal utrymmet.
Protocol
Representative Results
Discussion
I detta protokoll beskrivs generationen av en stor-eyed modell GA och prekliniska användning för att utvärdera hESC-RPE integration i vivo .
För översättning av regenerativa behandlingar för GA och relaterade sjukdomar till den klinik7är det viktigt att utveckla och optimera metoder som troget fånga kliniska metoder för transplantation och imaging. Kaninen är i denna attraktiva aspekt: den har ett relativt stort öga som möjliggör intraokulär kiru…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie stöddes av bidrag från Karolinska Institutet, Kronprinsessan Margaretas stiftelse för synskadade, Edwin Jordan grunden för oftalmologisk forskning, Stiftelsen öga, kung Gustav V Foundation, ARMEC Lindeberg stiftelsen och stiftelsen Cronqvist.
Materials
| NutriStem hESC XF differentiation medium –bFGF and –TGFb | Biological Industries | 06-5100-01-1A | |
| TrypLE Select 1x | Gibco, ThermoFisher Scientific Corp | 12563-011 | |
| PBS without Ca2+ and Mg2+ | Gibco, ThermoFisher Scientific Corp | 14190-094 | |
| Cell strainer 40 μm Nylon | VWR | 732-2757 | |
| Needle 30g 0.5’’; 0.3 x 13mm | BD Microlance | 304827 | |
| Acrodisc 25mm Syringe Filter | Acrodisc | PN4612 | |
| 0.4 % trypan blue | ThermoFisher Scientific Corp | 15250061 | Use at 0.2% |
| NaIO3 | Sigma-Aldrich Corp | S4007 | |
| BSS | Alcon Nordic A/S | 65079550 | |
| 70% Ethanol | Solveco AB | 1047 | |
| Ketaminol, 100 mg/mL | Intervet, Boxmeer | 511519 | Use 35 mg/kg ketamine |
| Rompun vet, 20 mg/mL | Bayer Animal Health | 22545 | Use 5 mg/kg xylazine |
| Triescence, 40 mg/mL | Alcon Nordic A/S | 412915 | 2 mg intraviterial |
| Cyklopentolat-phenylephrine, 0.75% + 2.5% | APL | 321968 | Use 1 drop in each eye |
| Viscotears | Laboratoires Théa | 597562 | |
| Topical saline | Apotea AB | 7053249369080 | |
| Allfatal vet. 100 mg/mL | Omnidea | 77168 | Use 100 mg/mL pentobarbital |
| Extension tube (Hammer) | MedOne Surgical Inc | 3223 | |
| 25G/38G polytip subretinal cannula | MedOne Surgical Inc | 3219 | 25G/38G |
| Single Use Flat Lens | Volk | #VWFD10 | |
| Barraquer Colibri lid retractor | AgnTho's AB | 42-020-030 | |
| Non-valved trocars | Alcon Nordic A/S | 8065751448 | |
| Clawed forceps | Bausch & Lomb Nordic AB | ET1811 | |
| Alcon Accurus 400VS Vitrectomy machine | Alcon Nordic A/S | 8065740238 | |
| Accurus 25+ Gauge Vitrectomy TotalL Plus Pak | Alcon Nordic A/S | 8065751493 | |
| SD-OCT device | Heidelberg Engineering | Spectralis HRA+OCT | Use Heidelberg Eye Explorer version 1.9.10.0 |
| 24 well plates | Sarstedt | 83.3922 | |
| Neubauer hemocytometer | VWR | 631-0925 | |
| New Zealand albino rabbits | Lidköpings Rabbit Farm, Sweden | ||
| hESC-RPE cells | See reference number 1 |
References
- Plaza Reyes, A., et al. Xeno-Free and Defined Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells Functionally Integrate in a Large-Eyed Preclinical Model. Stem Cell Rep. 6 (1), 9-17 (2016).
- Bartuma, H., et al. In Vivo Imaging of Subretinal Bleb-Induced Outer Retinal Degeneration in the Rabbit. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (4), 2423-2430 (2015).
- Petrus-Reurer, S., et al. Integration of Subretinal Suspension Transplants of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells in a Large-Eyed Model of Geographic Atrophy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (2), 1314-1322 (2017).
- Carido, M., et al. Characterization of a mouse model with complete RPE loss and its use for RPE cell transplantation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (8), 5431-5444 (2014).
- Lund, R. D., et al. Human embryonic stem cell-derived cells rescue visual function in dystrophic RCS rats. Cloning Stem Cells. 8 (3), 189-199 (2006).
- Vugler, A., et al. Elucidating the phenomenon of HESC-derived RPE: anatomy of cell genesis, expansion and retinal transplantation. Exp Neurol. 214 (2), 347-361 (2008).
- Schwartz, S. D., et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).
- Hughes, A. A schematic eye for the rabbit. Vision Res. 12 (1), 123-138 (1972).
- Blanch, R. J., Ahmed, Z., Berry, M., Scott, R. A., Logan, A. Animal models of retinal injury. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (6), 2913-2920 (2012).
- Nork, T. M., et al. Functional and anatomic consequences of subretinal dosing in the cynomolgus macaque. Arch Ophthalmol. 130 (1), 65-75 (2012).
