Met behulp van CRISPR/Cas9 Gene bewerken om te onderzoeken de oncogene activiteit van Mutant Calreticulin in Cytokine afhankelijke hematopoietische cellen
Summary
Gerichte gene bewerken met behulp van CRISPR/Cas9, heeft het inzicht in de biologische functies van genen aanzienlijk vergemakkelijkt. Hier, gebruiken we de methode van de CRISPR/Cas9 voor model calreticulin mutaties in cytokine-afhankelijke hematopoietische cellen om hun oncogene activiteit te bestuderen.
Abstract
Geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische herhaalt (CRISPR) is een adaptieve immuniteitssysteem in prokaryoten dat heeft geweest voorzien door wetenschappers voor het genereren van RNA-geleide nucleasen, zoals CRISPR-geassocieerde (Cas) 9 voor site-specific eukaryotische genoom bewerken. Genoom techniek door Cas9 wordt gebruikt voor het efficiënt, gemakkelijk en krachtig wijzigen endogene genen in vele biomedically relevante zoogdieren cellijnen en organismen. Hier laten we een voorbeeld van het gebruik van de methodologie van de CRISPR/Cas9 om te begrijpen van de biologische functie van specifieke genetische mutaties. We calreticulin (CALR) mutaties in lymfkliertest interleukine-3 (mIL-3) pro-B (Ba/F3) doelcellen model door levering van één gids RNAs (sgRNAs) gericht op de endogene Calr locus in de specifieke regio waar inbrengen en/of schrapping (indel ) CALR mutaties optreden bij patiënten met myeloproliferatieve gezwellen (MPN), een soort bloedkanker. Dubbele strand einden (DSBs) maken de sgRNAs in het gerichte gebied dat worden gerepareerd door niet-homologe einde deelname aan (NHEJ) zodat microdeleties van verschillende grootte. We gebruiken dan de standaard Ba/F3 cellulaire transformatie bepaling te begrijpen van het effect van fysiologische niveau expressie van mutaties van de Calr op hematopoietische cellulaire transformatie. Deze aanpak kan worden toegepast op andere genen te bestuderen van hun biologische functie in verschillende zoogdieren cellijnen.
Introduction
CRISPR/Cas9 technologie heeft onlangs een revolutie teweeggebracht in het bewerken van gerichte genoom in levende cellen en organismen. Het is uitgegroeid tot een zeer krachtig hulpmiddel voor biomedisch onderzoek en wordt momenteel gebruikt als een potentiële avenue voor behandeling van genetische ziekten1. De basis voor alle genoom bewerkingsgereedschappen steunt op de oprichting van een nuclease-geïnduceerde DNA dubbele gestrande pauze (DSB) aan de genomic locus worden gewijzigd. De DSBs kunnen worden gerepareerd door niet-homologe einde-lid te worden (NHEJ) of homologie geleide reparatie (HDR)2,3. Het voordeel van de Cas9 nuclease over andere genoom engineering nucleasen, zoals zink vinger nucleasen (ZFNs) en de transcriptie activator-achtige effector nucleasen (TALENs) is de afhankelijkheid van RNA voor het targeten van de nuclease naar een gewenste opeenvolging van DNA, vergeleken om de eiwit-DNA interacties gevonden in ZFNs en TALENs2,3.
Na de ontdekking van de CRISPR/Cas9 nuclease traject als een adaptieve immuunsysteem in prokaryotische cellen4,5, is veel moeite besteed aan de aanpassing van het traject voor gebruik in zoogdieren cellijnen en model organismen2, 3. als een hulpmiddel voor het bewerken van het gen, de CRISPR/Cas9-pathway maakt gebruik van twee hoofdonderdelen: de Streptococcus pyogenes (Sp) afgeleid Cas9 nuclease en sgRNAs gericht op het gen van belang2,3. De sgRNA bestaat uit 20 nucleotiden die directe Cas9 naar een specifieke site op het genoom door RNA-DNA basenpaar complementariteit2,3. De doelsite van de sgRNA moet liggen naast een protospacer aangrenzende motief (PAM) in de vorm van 5′ NGG, die is erkend door de SpCas9 nuclease. Met deze tools kan Cas9 worden omgeleid naar een DNA-sequentie door het ontwerpen van sgRNAs dat doel de regio van belang. Daarnaast Sp afgeleid Cas9, zijn er extra varianten voor Cas9 met verschillende functies afhankelijk van de specifieke toepassing. Er zijn bijvoorbeeld Cas9 varianten met hogere specificiteit voor het bewerken van de aan de doelsoort of single-strand decollete capaciteit voor DNA plukt6,7. Bovendien is onlangs catalytically inactieve Cas9 ontwikkeld voor transcriptionele voorschrift8. Wetenschappers hebben nu de CRISPR/Cas9-systeem gebruikt voor een verscheidenheid van toepassingen, zoals gene knockin en knock-out te bestuderen van de biologische functies van genen9, verlies-van-functie en winst-van-functie bibliotheek schermen10 en genetische Engineering van model organismen11.
In dit protocol combineren we de methodologie van de CRISPR/Cas9 met de bepaling van de cellulaire transformatie Ba/F3 te begrijpen van de biologische functie van CALR mutaties. BA/F3 cellen zijn een lymfkliertest IL-3 hematopoietische doelcel lijn die kan worden gerenderd IL-3 onafhankelijke op expressie van bepaalde oncogenen zoals BCR-ABL12. Om te begrijpen of mutant calreticulin Ba/F3 cellen cytokine onafhankelijke groei kan transformeren, we gericht exon 9 van de endogene Calr locus met behulp van CRISPR/Cas9 te voeren indel mutaties en trok vervolgens IL-3 uit de cellen toe te passen een positieve selectiedruk, met als doel Recapitulerend winst-van-functie CALR mutaties gevonden in MPN patiënten. Het protocol bevat het ontwerp, het klonen en de levering van sgRNAs, de ontwikkeling van stabiele Cas9 waarin cellen en screening voor CRISPR op doelsoort gene bewerken. Dit protocol kan worden toegepast op verschillende genen en verschillende cytokine-afhankelijke cellijnen van belang en is vooral waardevol in modellering en het bestuderen van de biologische functie van genen betrokken bij kanker.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier tonen we het gebruik van CRISPR/Cas9 gene bewerken om te bestuderen van de biologische functie van CALR mutaties in hematopoietische cellen. Het succes van dit protocol is sterk afhankelijk van meerdere factoren. Ten eerste is het belangrijk om te weten wat voor soort mutaties mogelijk verantwoordelijk voor het fenotype dat gewenst is. In dit protocol, de uitlezing is de transformatie van Ba/F3 cellen mIL-3 onafhankelijkheid en de soorten mutaties zijn microdeleties in exon 9 van CALR. Echter, als …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de NIH (R01HL131835), een Damon Runyon klinisch onderzoeker award en de Starr kanker Consortium.
Materials
| BsmBI | New England Biolabs | R0580L | |
| Blasticidin | Sigma Aldrich | 15025 | |
| Puromycin | Life Technologies | A1113803 | |
| Stbl3 cells | Life Technologies | C737303 | |
| TransIT-LT1 | Thermo Fisher Scientific | MIR2300 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 51985034 | |
| RPMI | Thermo Fisher Scientific | MT10040CV | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 10-017-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Omega Scientific | FB-11 | |
| Penicillin/streptomycin/L-glutamine | Life Technologies | 10378016 | |
| mIL-3 | Peprotech | 213-13 | |
| psPAX2 | Addgene | N/A | |
| pCMV-VSV-G | Addgene | N/A | |
| pLX_TRC311-Cas9 | Addgene | N/A | |
| polybrene | Sigma Aldrich | H9268 | |
| pXPR-011 | Addgene | N/A | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Genessee Scientific | 25-507 | |
| TAE buffer | Thermo Fisher Scientific | FERB49 | |
| LentiGuide-Puro | Addgene | Plasmid #52963 | |
| PNK | New England Biolabs | M0201S | |
| T4 ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Miniprep kit | Qiagen | 27104 |
References
- DeWitt, M. A., et al. Selection-free genome editing of the sickle mutation in human adult hematopoietic stem/progenitor cells. Sci Trans Med. 8, 360 (2016).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 4, 347-355 (2014).
- Gaj, T., Gerbach, C. A., Barbas, C. F. ZFN, TALEN, CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends Biotechnol. 31 (7), 397-405 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Wiedenheft, B., Samuel, S. H., Doudna, J. A. RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archea. Nature. 482 (7385), 331-338 (2012).
- Slaymaker, I. M., Gao, L., Zetsche, B., Scott, D. A., Yan, W. X., Zhang, F. Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity. Science. 351 (6268), 84-88 (2016).
- Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).
- Larson, M. H., et al. CRISPR interference (CRISPRi) for sequence-specific control of gene expression. Nat Protoc. 8 (11), 2180-2196 (2013).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
- Kim, H. S., et al. CRISPR/Cas9-mediated Gene-knockout screens and target identification via Whole genome sequencing uncover host genes required for picornavirus infection. J Biol Chem. 10, 1074 (2017).
- Heckl, D., et al. Generation of mouse models of myeloid malignancies with combinatorial genetic lesions using CRISPR-Cas9 genome editing. Nat Biotechnol. 32 (9), 941-946 (2014).
- Daley, G. Q., Baltimore, D. Transformation of an interleukin 3-dependent hematopoietic cell line by the chronic myelogenous leukemia-specific bcr/abl protein. Proc Natl Acad Sci USA. 85, 9312-9316 (1988).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biol. 17, 148 (2016).
- Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nat Biotechnol. 32, 1262-1267 (2014).
- Brinkman, E. K., et al. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucl Acid Res. 42, e168 (2014).
- Klampfl, T., et al. Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms. N Engl J Med. 369, 2379-2390 (2013).
- Nangalia, J., et al. Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2. N Engl J Med. 369, 2391-2405 (2013).
- Elf, S., et al. Mutant Calreticulin requires both its mutant C-terminus and the thrombopoietin receptor for oncogenic transformation. Cancer Discovery. 6 (4), 368-381 (2016).
- Bauer, D. E., Canver, M. C., Orkin, S. H. Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell lines via CRISPR/Cas9. J. Vis. Exp. (95), e52118 (2015).
- Watanabe-Smith, K., et al. Analysis of acquired mutations in transgenes arising in Ba/F3 transformation assays: findings and recommendations. Oncotarget. 8, 12596-12606 (2017).
- Fu, Y., et al. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. NatBiotechnol. 32, 279-284 (2014).
