Mit CRISPR/Cas9 gen untersuchen die Onkogene Aktivität des mutierten Calreticulin in Cytokine abhängigen hämatopoetischen Zellen bearbeiten
Summary
Gezielte gen bearbeiten CRISPR/Cas9 hat das Verständnis der biologischen Funktionen der Gene erheblich erleichtert. Hier nutzen wir die CRISPR/Cas9-Methodik zu Modell Calreticulin Mutationen in hämatopoetischen Zellen Zytokin-abhängige um ihre onkogenen Aktivität zu studieren.
Abstract
Gruppierte regelmäßig dazwischen kurze palindromische Wiederholungen (CRISPR) ist eine adaptive Immunsystem in Prokaryoten, die von Wissenschaftlern, RNA-geführte Nukleasen wie CRISPR-assoziierten (Cas) 9 für standortspezifische eukaryotische Genom zu generieren umgewidmet worden bearbeiten. Genom-Engineering von Cas9 wird verwendet, um effizient, leicht und robust endogene Gene in vielen biomedizinisch relevante Säugetieren Zelllinien und Organismen ändern. Hier zeigen wir ein Beispiel dafür, wie die CRISPR/Cas9 Methode um zu verstehen, die biologische Funktion von bestimmten genetischen Mutationen zu nutzen. Wir modellieren Calreticulin (Carl) Mutationen im murinen Interleukin-3 (mIL-3) abhängigen Pro-B (Ba/F3) Zellen durch Lieferung von einzelnen Guide RNAs (SgRNAs) gezielt den endogenen Carl Locus in der jeweiligen Region wo einsetzen und/oder Löschung (Indel ) Carl Mutationen bei Patienten mit myeloproliferative Neoplasmen (MPN), eine Art Blutkrebs. Die SgRNAs erstellen Doppelstrang Brüche (DSB) in der gezielten Region, die von nicht-homologe Ende verbinden (NHEJ) um Indels in verschiedenen Größen geben ausgebessert werden. Dann setzen wir den standard Ba/F3 zellulären Transformation Assay, die Wirkung der physiologischen Ebene Ausdruck von Carl Mutationen auf hämatopoetischen zellulären Transformation zu verstehen. Dieser Ansatz kann auf andere Gene, ihre biologische Funktion in verschiedenen Säugetieren Zelllinien zu studieren angewendet werden.
Introduction
CRISPR/Cas9 hat vor kurzem revolutioniert gezielte Genom-Bearbeitung in lebenden Zellen und Organismen. Es ist ein äußerst leistungsfähiges Werkzeug für die biomedizinische Forschung geworden und wird derzeit als ein möglicher Weg für Therapie von Erbkrankheiten1genutzt werden. Die Grundlage für alle Genome editing-Tools stützt sich auf die Schaffung einer Nuklease-induzierten DNA gestrandeten Doppelunterbrechung (DSB) auf der genomischen Lokus geändert werden. Die DSB können durch nicht-homologe Ende verbinden (NHEJ) oder unter der Regie von Homologie Reparatur (HDR)2,3repariert werden. Der Vorteil der Cas9 Nuklease über andere Genom engineering Nukleasen wie Zink-Finger-Nukleasen (ZFN) und Transkription Aktivator-ähnliche Effektor Nukleasen (TALENs) ist seine Abhängigkeit von RNA für die Ausrichtung der Nuklease an eine gewünschte DNA-Sequenz im Vergleich auf die Protein-DNA-Wechselwirkungen in ZFN und TALENs2,3gefunden.
Nach der Entdeckung des CRISPR/Cas9-Nuklease-Signalwegs als adaptive Immunsystem in prokaryotischen Zellen4,5steckt viel Aufwand in der Anpassung des Weges für den Einsatz in Säugetieren Zelllinien und Modell Organismen2, 3. als ein Werkzeug für die Bearbeitung von gen CRISPR/Cas9 Weg nutzt zwei Hauptkomponenten: dem Streptococcus Pyogenes (Sp) abgeleitet Cas9 Nuklease und SgRNAs gezielt das Gen von Interesse2,3. Die SgRNA besteht aus 20 Nukleotide, direkte Cas9 auf eine bestimmte Website über das Genom durch RNA-DNA-Basenpaare Komplementarität2,3. Der Ziel-Site von den SgRNA muss neben einer Protospacer angrenzenden Motiv (PAM) in Form von 5′ NGG, liegen die von der SpCas9-Nuklease anerkannt wird. Mit diesen Werkzeugen kann Cas9 an jeder DNA-Sequenz richten, durch die Gestaltung SgRNAs dieses Ziels der Region von Interesse. Darüber hinaus Sp abgeleitet Cas9, gibt es weitere Varianten für Cas9 mit verschiedenen Funktionen je nach Anwendungsfall. Zum Beispiel gibt es Cas9 Varianten mit höhere Spezifität für die zielgenaue Bearbeitung oder Einzel-Strang Spaltung Kapazität für DNA nicking6,7. Darüber hinaus wurde katalytisch inaktive Cas9 vor kurzem für transcriptional Regelung8entwickelt. Wissenschaftler haben nun das CRISPR/Cas9-System für eine Vielzahl von Anwendungen, z. B. gen Profi und Knockout für die biologischen Funktionen der Gene9, Verlust der Funktion und Gewinn der Funktion Bibliothek Bildschirme10 und genetische Studie verwendet. Engineering von Modell Organismen11.
In diesem Protokoll verbinden wir die CRISPR/Cas9-Methodik mit Ba/F3 zellulären Transformation Assays, die biologische Funktion von Carl Mutationen zu verstehen. BA/F3-Zellen sind eine murinen IL-3 angewiesen hämatopoetische Zelllinie, die IL-3 gerendert werden kann unabhängig auf Ausdruck bestimmter Onkogene wie BCR-ABL-12. Um zu verstehen, ob mutierten Calreticulin Ba/F3 Zellen Zytokin unabhängiges Wachstum verändern kann, wir gezielte Exon 9 der endogenen Carl -Locus mit CRISPR/Cas9 Indel Mutationen einführen und dann zog sich IL-3 aus den Zellen anwenden eine positive Selektionsdruck, mit dem Ziel der Rekapitulation Gain of Function Carl Mutationen bei MPN Patienten gefunden. Das Protokoll umfasst Planung, Klonen und Lieferung von SgRNAs, die Entwicklung von stabilen Cas9 mit dem Ausdruck ihrer Zellen und Screening für CRISPR zielgerichtet gen zu bearbeiten. Dieses Protokoll kann auf verschiedene Gene und verschiedenen Zytokin-abhängige Zelllinien von Interesse angewendet werden und ist besonders wertvoll bei der Modellierung und die biologische Funktion von Genen, die in der Krebstherapie zu studieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier zeigen wir die Verwendung von CRISPR/Cas9 gen bearbeiten, um die biologische Funktion von Carl Mutationen in hämatopoetischen Zellen zu untersuchen. Der Erfolg dieses Protokolls ist stark abhängig von mehreren Faktoren ab. Erstens ist es wichtig zu wissen, welche Arten von Mutationen für den Phänotyp verantwortlich sind, die gewünscht wird. In diesem Protokoll die Anzeige ist die Umwandlung von Ba/F3 Zellen mIL-3 Unabhängigkeit und die Arten von Mutationen sind Indels im Exon 9 von Carl. Wenn…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von den NIH (R01HL131835), dem Damon Runyon Klinischer Prüfarzt Award und Starr Cancer Consortium unterstützt.
Materials
| BsmBI | New England Biolabs | R0580L | |
| Blasticidin | Sigma Aldrich | 15025 | |
| Puromycin | Life Technologies | A1113803 | |
| Stbl3 cells | Life Technologies | C737303 | |
| TransIT-LT1 | Thermo Fisher Scientific | MIR2300 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 51985034 | |
| RPMI | Thermo Fisher Scientific | MT10040CV | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 10-017-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Omega Scientific | FB-11 | |
| Penicillin/streptomycin/L-glutamine | Life Technologies | 10378016 | |
| mIL-3 | Peprotech | 213-13 | |
| psPAX2 | Addgene | N/A | |
| pCMV-VSV-G | Addgene | N/A | |
| pLX_TRC311-Cas9 | Addgene | N/A | |
| polybrene | Sigma Aldrich | H9268 | |
| pXPR-011 | Addgene | N/A | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Genessee Scientific | 25-507 | |
| TAE buffer | Thermo Fisher Scientific | FERB49 | |
| LentiGuide-Puro | Addgene | Plasmid #52963 | |
| PNK | New England Biolabs | M0201S | |
| T4 ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Miniprep kit | Qiagen | 27104 |
References
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