Utilizzando CRISPR/Cas9 Gene Editing per studiare l'attività oncogena di calreticulina mutante in cellule ematopoietiche Cytokine dipendente
Summary
Genica mirata di editing con CRISPR/Cas9 ha notevolmente facilitato la comprensione delle funzioni biologiche dei geni. Qui, utilizziamo la metodologia CRISPR/Cas9 a modello calreticulina mutazioni in cellule ematopoietiche citochina-dipendente al fine di studiare la loro attività oncogena.
Abstract
Cluster regolarmente intercapedine ripetizioni brevi palindromi (CRISPR) è un sistema di immunità adattativa nei procarioti che è stato reimpiegato dagli scienziati per generare nucleasi RNA-guidato, come ad esempio CRISPR-collegata (Cas) 9 per site-specific genoma eucariotico di editing. Ingegneria del genoma da Cas9 viene utilizzato per in modo efficiente, robusta e facilmente modificare geni endogeni in molte linee cellulari di mammifero biomediche pertinenti e organismi. Qui vi mostriamo un esempio di come utilizzare la metodologia CRISPR/Cas9 per comprendere la funzione biologica di mutazioni genetiche specifiche. Abbiamo il modello calreticulina (CALR) mutazioni in murino interleukin-3 (mIL-3) pro-B (Ba/F3) le celle dipendenti dalla consegna di guida singola RNAs (sgRNAs) targeting per il locus Calr endogeno nella regione specifica dove inserimento e/o cancellazione (indel ) CALR mutazioni si verificano in pazienti con neoplasie mieloproliferative (MPN), un tipo di tumore del sangue. La sgRNAs creare doppio filo (DSBs) nella regione mirata che sono riparati da non-omologo fine unirsi (NHEJ) per dare indels di varie dimensioni. Utilizziamo quindi il test di trasformazione cellulare Ba/F3 standard per comprendere l’effetto dell’espressione di livello fisiologico di Calr mutazioni sulla trasformazione cellulare ematopoietico. Questo approccio può essere applicato ad altri geni di studiare la loro funzione biologica in varie linee cellulari di mammifero.
Introduction
CRISPR/Cas9 tecnologia recentemente ha rivoluzionato l’editing genomico mirato negli organismi e cellule viventi. È divenuto uno strumento estremamente potente per la ricerca biomedica e attualmente viene utilizzato come un viale potenziale per la terapia di malattie genetiche1. La base per tutti gli strumenti di editing del genoma si basa sulla creazione di una nucleasi-indotta rottura del DNA doppia filamento (DSB) presso il locus genomico per essere modificato. Il DSBs può essere riparato da fine-unirsi non-omologo (NHEJ) o riparazione omologia-diretto (HDR)2,3. Il vantaggio della nucleasi Cas9 sopra altri genoma ingegneria nucleasi, quali nucleasi a dita di zinco (ZFNs) e nucleasi di trascrizione attivatore-come effettore (TALENs) è la dipendenza dal RNA per il targeting della nucleasi a una sequenza di DNA desiderata, rispetto le interazioni proteina-DNA trovato in ZFNs e TALENs2,3.
Dopo la scoperta del pathway di nucleasi CRISPR/Cas9 come un sistema immunitario adattativo in cellule procariotiche4,5, molto sforzo è andato in adattando la via per l’uso in linee cellulari di mammifero e modello organismi2, 3. come strumento per l’editing di gene, il pathway CRISPR/Cas9 utilizza due componenti principali: Streptococcus pyogenes (Sp) derivato Cas9 nucleasi e sgRNAs del gene di interesse2,3di targeting. Il sgRNA è costituito da 20 nucleotidi che Cas9 diretto a un sito specifico sul genoma a RNA-DNA base pair complementarità2,3. Il sito di destinazione del sgRNA deve trovarsi adiacente a un sito di motivi adiacenti (PAM) protospacer sotto forma di 5′ NGG, che è riconosciuto dalla nucleasi SpCas9. Con questi strumenti, Cas9 può essere diretto a qualsiasi sequenza di DNA con la progettazione di sgRNAs che hanno come destinazione la regione di interesse. Inoltre, Sp derivato Cas9, esistono varianti supplementari per Cas9 con caratteristiche diverse a seconda dell’applicazione specifica. Ad esempio, ci sono varianti di Cas9 con maggiore specificità per l’editing on target o capacità di single-strand fenditura per DNA intaccare6,7. Inoltre, cataliticamente inattivo Cas9 recentemente è stata sviluppata per regolazione trascrizionale8. Gli scienziati ora hanno utilizzato il sistema CRISPR/Cas9 per una varietà di applicazioni, ad esempio Knockin ‘ genica e knockout per studiare le funzioni biologiche di geni9, perdita di funzione e guadagno di funzione libreria schermi10 e genetica Ingegneria di organismi modello11.
In questo protocollo, uniamo la metodologia CRISPR/Cas9 con il saggio di trasformazione cellulare Ba/F3 a capire la funzione biologica di CALR mutazioni. Le cellule Ba/F3 sono una linea di cellule ematopoietiche dipendente dal-3 murina che può essere reso IL-3 indipendente sull’espressione di alcuni oncogeni come BCR-ABL12. Al fine di comprendere se calreticulina mutante può trasformare le cellule Ba/F3 alla citochina crescita indipendente, abbiamo mirato dell’essone 9 del locus endogeno Calr usando CRISPR/Cas9 per introdurre le mutazioni indel e quindi si ritirò IL-3 dalle cellule per applicare un pressione di selezione positiva, con l’obiettivo di guadagno di funzione CALR le mutazioni trovate in pazienti MPN di ricapitolare. Il protocollo comprende la progettazione, la clonazione e la consegna di sgRNAs, lo sviluppo di cellule esprimenti Cas9 stabili e screening per CRISPR gene editing on target. Questo protocollo può essere applicato a diversi geni e varie linee di citochina-dipendente delle cellule di interesse ed è particolarmente prezioso nella modellazione e studiando la funzione biologica di geni coinvolti nel cancro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui dimostriamo l’uso di CRISPR/Cas9 gene editing per studiare la funzione biologica di CALR mutazioni nelle cellule ematopoietiche. Il successo di questo protocollo è altamente dipendente da molteplici fattori. In primo luogo, è importante sapere quali tipi di mutazioni possono essere responsabili del fenotipo che è desiderato. In questo protocollo, la lettura è la trasformazione delle cellule Ba/F3 per mIL-3 indipendenza e i tipi di mutazioni sono indels in essone 9 di CALR. Tuttavia, se la mutazi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da NIH (R01HL131835), un premio di ricercatore clinico di Damon Runyon e il Consorzio di cancro Starr.
Materials
| BsmBI | New England Biolabs | R0580L | |
| Blasticidin | Sigma Aldrich | 15025 | |
| Puromycin | Life Technologies | A1113803 | |
| Stbl3 cells | Life Technologies | C737303 | |
| TransIT-LT1 | Thermo Fisher Scientific | MIR2300 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 51985034 | |
| RPMI | Thermo Fisher Scientific | MT10040CV | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 10-017-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Omega Scientific | FB-11 | |
| Penicillin/streptomycin/L-glutamine | Life Technologies | 10378016 | |
| mIL-3 | Peprotech | 213-13 | |
| psPAX2 | Addgene | N/A | |
| pCMV-VSV-G | Addgene | N/A | |
| pLX_TRC311-Cas9 | Addgene | N/A | |
| polybrene | Sigma Aldrich | H9268 | |
| pXPR-011 | Addgene | N/A | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Genessee Scientific | 25-507 | |
| TAE buffer | Thermo Fisher Scientific | FERB49 | |
| LentiGuide-Puro | Addgene | Plasmid #52963 | |
| PNK | New England Biolabs | M0201S | |
| T4 ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Miniprep kit | Qiagen | 27104 |
References
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