CRISPR/Cas9 kullanarak Gene sitokin bağımlı hematopoetik hücreler Mutant Calreticulin Oncogenic etkinliğini araştırmak için düzenleme
Summary
CRISPR/Cas9 kullanarak hedeflenen gen düzenleme büyük ölçüde anlayış genlerin biyolojik fonksiyonların kolaylaştırdı. Burada, biz oncogenic faaliyetlerini incelemek için model calreticulin mutasyonların sitokin bağımlı hematopoetik hücreler için CRISPR/Cas9 metodoloji kullanmaktadır.
Abstract
Kümelenmiş düzenli olarak interspaced kısa palindromik yineler (CRISPR) olduğunu CRISPR ilişkili (CA’lar) 9 için siteye özgü ökaryotik genom gibi RNA güdümlü enzimler üretmek için bilim adamları tarafından repurposed prokaryot bir adaptif bağışıklık sisteminde düzenleme. Genom mühendislik Cas9 tarafından verimli bir şekilde, kolayca ve sağlam çok biomedically ilgili memeli hücre satırları ve organizmaların endojen genlerinde değiştirmek için kullanılır. İşte belirli Genetik mutasyonlar biyolojik işlevini anlamak için CRISPR/Cas9 metodoloji kullanmak nasıl bir örnek göstermektedir. Tek Kılavuzu RNA’ların (sgRNAs) endojen Calr odağı belirli bölgedeki hedefleme teslimini tarafından fare İnterlökin-3 (MIL-3) bağımlı pro-B (Ba/F3) hücreleri mutasyonların calreticulin (CALR) model nerede ekleme ve/veya silme (Indel ) CALR mutasyonlar meydana miyoproliferatif neoplazmlar (MPN), bir tür kan kanseri olan hastalarda. SgRNAs Çift Kişilik kırılmalara (DSBs) (NHEJ) indels irili ufaklı vermek katılmadan homolog olmayan sonunda tamir hedeflenen bölge oluşturun. Sonra standart Ba/F3 hücresel dönüştürme tahlil hematopoetik hücresel dönüşümü konusunda Calr mutasyonların fizyolojik düzey ifade etkisini anlamak için kullanıyoruz. Bu yaklaşım onların biyolojik işlevi çeşitli memeli hücre hatlarında çalışmaya diğer genler uygulanabilir.
Introduction
CRISPR/Cas9 teknoloji son zamanlarda hedeflenen genom düzenleme canlı hücreler ve organizmaların devrim yarattı. Biyomedikal Araştırma son derece güçlü bir araç haline gelmiştir ve terapi genetik hastalıklar1için potansiyel bir cadde olarak şu anda kullanılmaktadır. Tüm genom düzenleme araçları için temel nükleaz kaynaklı DNA çift telli mola (DSB) oluşturma’değiştirilecek genomik odağı dayanır. DSBs homolog sonu-katılma (NHEJ) veya onarım homoloji-yönetmen (HDR)2,3tarafından tamir edilebilir. Enzimler, çinko parmak enzimler (ZFNs) gibi mühendislik diğer genom üzerinde Cas9 nükleaz ve transkripsiyon harekete geçirmek gibi efektör enzimler (TALENs) RNA onun bağımlılığı nükleaz karşılaştırıldığında istenen bir DNA dizisi için hedefleme için avantajdır ZFNs ve TALENs2,3‘ te bulunan protein-DNA etkileşimleri için.
CRISPR/Cas9 nükleaz yolu olarak edinilmiş bağışıklık sistemi prokaryotik hücreler4,5keşfi sonra memeli hücre satırları ve model organizmalar2, kullanmak için yolu uyum içine çok çaba gitti 3. gen düzenleme için bir araç olarak CRISPR/Cas9 yolu iki ana bileşenleri kullanır: Cas9 nükleaz ve faiz2,3gen hedefleme sgRNAs Streptococcus pyogenes (Sp) türetilmiştir. SgRNA 20 nükleotit ile RNA-DNA baz çifti tamamlayıcılık2,3genom üzerinde belirli bir siteye doğrudan o Cas9 oluşur. SgRNA hedef sitenin şeklinde 5′ NGG, SpCas9 nükleaz tarafından tanınan bir protospacer bitişik motifi (PAM) siteye bitişik yalan gerekir. Bu araçlarla Hedef bölgenin ilgi sgRNAs tasarlayarak herhangi bir DNA dizisi Cas9 yönlendirilmiş olabilirsiniz. Ayrıca Sp elde Cas9 için ek türevleri vardır Cas9 için belirli uygulamaya bağlı olarak, farklı özelliklere sahip. Örneğin, hedef olarak düzenlemek için daha yüksek özgüllüğü veya6,7nicking DNA için tek iplikçikli bölünme kapasitesi ile Cas9 türevleri vardır. Ayrıca, catalytically etkin olmayan Cas9 son zamanlarda transkripsiyon Yönetmeliği8için geliştirilmiştir. Bilim adamları şimdi gene knockin ve biyolojik işlevleri genler9, fonksiyon kaybı ve kazanç işlev kitaplığı ekranlar10 ve genetik çalışma için Boşalt’ı gibi uygulamalar çeşitli için CRISPR/Cas9 sistemi kullandık Mühendislik model organizmalar11.
Bu protokol için CALR mutasyonların biyolojik işlevi anlamaya Ba/F3 hücresel dönüştürme tahlil ile CRISPR/Cas9 metodoloji birleştirir. Ba/F3 hücrelerdir IL-3 işlenebilir bir fare IL-3 bağımlı hematopoietik hücre satır belirli oncogenes BCR-ABL12gibi ifade üzerine bağımsız. Mutant calreticulin sitokin bağımsız büyüme Ba/F3 hücrelere dönüşümü olup olmadığını anlamak için exon 9 CRISPR/Cas9 Indel mutasyonlar tanıtmak kullanarak endojen Calr odağı hedef ve uygulamak için hücrelerden IL-3 geri çekti bir MPN hastalarda bulunan işlev kazanç CALR mutasyonlar recapitulating amacı ile pozitif seçim basınç. Ve tarama CRISPR için Tarih-hedef gen düzenleme protokol tasarımı, klonlama ve sgRNAs, istikrarlı Cas9 ifade hücre gelişimi teslimini içerir. Bu iletişim kuralı farklı genler ve çeşitli sitokin bağımlı hücre satırları ilgi için uygulanabilir ve modelleme ve genler kanseri dahil biyolojik işlev eğitim özellikle değerlidir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada CRISPR/Cas9 CALR mutasyonlar hematopoetik hücrelerin biyolojik fonksiyonu çalışmaya gen düzenleme kullanımını göstermektedir. Bu iletişim kuralı başarısı son derece birden fazla faktöre bağlıdır. İlk olarak, ne tür mutasyon isteniyorsa fenotip için sorumlu olabilir bilmek önemlidir. Bu iletişim kuralı ‘ okuma MIL-3 bağımsızlık Ba/F3 hücrelerine dönüşüm ve mutasyonlar exon 9 CALRindels türleridir. İstenen mutasyon tek baz çifti ikame ise, çünkü hassas nokta m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser NIH (R01HL131835), Damon Runyon’un klinik Araştırmacı Ödülü ve Starr Kanser Konsorsiyumu tarafından desteklenmiştir.
Materials
| BsmBI | New England Biolabs | R0580L | |
| Blasticidin | Sigma Aldrich | 15025 | |
| Puromycin | Life Technologies | A1113803 | |
| Stbl3 cells | Life Technologies | C737303 | |
| TransIT-LT1 | Thermo Fisher Scientific | MIR2300 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 51985034 | |
| RPMI | Thermo Fisher Scientific | MT10040CV | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 10-017-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Omega Scientific | FB-11 | |
| Penicillin/streptomycin/L-glutamine | Life Technologies | 10378016 | |
| mIL-3 | Peprotech | 213-13 | |
| psPAX2 | Addgene | N/A | |
| pCMV-VSV-G | Addgene | N/A | |
| pLX_TRC311-Cas9 | Addgene | N/A | |
| polybrene | Sigma Aldrich | H9268 | |
| pXPR-011 | Addgene | N/A | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Genessee Scientific | 25-507 | |
| TAE buffer | Thermo Fisher Scientific | FERB49 | |
| LentiGuide-Puro | Addgene | Plasmid #52963 | |
| PNK | New England Biolabs | M0201S | |
| T4 ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Miniprep kit | Qiagen | 27104 |
References
- DeWitt, M. A., et al. Selection-free genome editing of the sickle mutation in human adult hematopoietic stem/progenitor cells. Sci Trans Med. 8, 360 (2016).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 4, 347-355 (2014).
- Gaj, T., Gerbach, C. A., Barbas, C. F. ZFN, TALEN, CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends Biotechnol. 31 (7), 397-405 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Wiedenheft, B., Samuel, S. H., Doudna, J. A. RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archea. Nature. 482 (7385), 331-338 (2012).
- Slaymaker, I. M., Gao, L., Zetsche, B., Scott, D. A., Yan, W. X., Zhang, F. Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity. Science. 351 (6268), 84-88 (2016).
- Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).
- Larson, M. H., et al. CRISPR interference (CRISPRi) for sequence-specific control of gene expression. Nat Protoc. 8 (11), 2180-2196 (2013).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
- Kim, H. S., et al. CRISPR/Cas9-mediated Gene-knockout screens and target identification via Whole genome sequencing uncover host genes required for picornavirus infection. J Biol Chem. 10, 1074 (2017).
- Heckl, D., et al. Generation of mouse models of myeloid malignancies with combinatorial genetic lesions using CRISPR-Cas9 genome editing. Nat Biotechnol. 32 (9), 941-946 (2014).
- Daley, G. Q., Baltimore, D. Transformation of an interleukin 3-dependent hematopoietic cell line by the chronic myelogenous leukemia-specific bcr/abl protein. Proc Natl Acad Sci USA. 85, 9312-9316 (1988).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biol. 17, 148 (2016).
- Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nat Biotechnol. 32, 1262-1267 (2014).
- Brinkman, E. K., et al. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucl Acid Res. 42, e168 (2014).
- Klampfl, T., et al. Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms. N Engl J Med. 369, 2379-2390 (2013).
- Nangalia, J., et al. Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2. N Engl J Med. 369, 2391-2405 (2013).
- Elf, S., et al. Mutant Calreticulin requires both its mutant C-terminus and the thrombopoietin receptor for oncogenic transformation. Cancer Discovery. 6 (4), 368-381 (2016).
- Bauer, D. E., Canver, M. C., Orkin, S. H. Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell lines via CRISPR/Cas9. J. Vis. Exp. (95), e52118 (2015).
- Watanabe-Smith, K., et al. Analysis of acquired mutations in transgenes arising in Ba/F3 transformation assays: findings and recommendations. Oncotarget. 8, 12596-12606 (2017).
- Fu, Y., et al. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. NatBiotechnol. 32, 279-284 (2014).
