वृद्धि का प्रवाह के साथ बमबारी जौ Aleurone परतों में जीन अभिव्यक्ति मापने
Summary
एक बेहतर प्रोटोकॉल रिपोर्टर से क्षणिक जीन अभिव्यक्ति की माप के लिए प्रस्तुत किया जाता है कण बमबारी के बाद जौ aleurone कोशिकाओं में constructs । स्वचालित के साथ पीस अनाज का संयोजन 96-अच्छी तरह से प्लेट एंजाइम परख प्रक्रिया के लिए उच्च प्रवाह प्रदान करता है ।
Abstract
जौ अनाज की aleurone परत पौधों में हार्मोन विनियमित जीन अभिव्यक्ति के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल प्रणाली है । aleurone कोशिकाओं में, अंकुरण या जल्दी अंकुर विकास के लिए आवश्यक जीन gibberellin (GA) द्वारा सक्रिय कर रहे हैं, जबकि तनाव प्रतिक्रियाओं से जुड़े जीन abscisic एसिड (आबा) द्वारा सक्रिय कर रहे हैं । GA और आबा संकेतन के तंत्र कण बमबारी के माध्यम से aleurone कोशिकाओं में रिपोर्टर जीन का निर्माण शुरू करने से पूछताछ की जा सकती है, जिसके परिणामस्वरूप क्षणिक अभिव्यक्ति एंजाइम परख का उपयोग कर मापा के साथ । एक बेहतर प्रोटोकॉल की सूचना दी है कि आंशिक रूप से स्वचालित रूप से और अनाज homogenization कदम और एंजाइम परख को कारगर बनाने, मौजूदा तरीकों से काफी अधिक प्रवाह की अनुमति । अनाज के नमूनों की Homogenization एक स्वचालित ऊतक homogenizer का उपयोग कर बाहर किया जाता है, और गस (β-glucuronidase) परख एक 96-अच्छी तरह से प्लेट प्रणाली का उपयोग कर बाहर किया जाता है । प्रतिनिधि प्रोटोकॉल का उपयोग कर परिणाम सुझाव है कि phospholipase डी गतिविधि आबा द्वारा, प्रतिलेखन कारक TaABF1 के माध्यम से HVA1 जीन अभिव्यक्ति के सक्रियकरण में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकता है ।
Introduction
जौ aleurone परत हार्मोन के अध्ययन के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित मॉडल प्रणाली है-पौधों में जीन अभिव्यक्ति विनियमित1। विशेष रूप से, अंकुरण या जल्दी अंकुर विकास के लिए आवश्यक जीन की एक संख्या gibberellin (GA) द्वारा सक्रिय कर रहे हैं, जबकि तनाव प्रतिक्रियाओं से जुड़े जीन abscisic एसिड (आबा) द्वारा सक्रिय कर रहे हैं । ga और आबा सिग्नलिंग मार्ग intertwined हैं, कुछ ga-सक्रिय जीनों की अभिव्यक्ति के रूप में आबा द्वारा हिचकी है, और प्रतिकूल1।
GA/आबा संकेतन में विशेष अभिनेताओं की भूमिका को समझने के लिए एक मूल्यवान रणनीति कण बमबारी के माध्यम से प्रभाव जीन constructs का परिचय दिया गया है, रिपोर्टर के क्षणिक अभिव्यक्ति के बाद constructs कि जिसके परिणामस्वरूप प्रभाव की अनुमति बहाव जीन अभिव्यक्ति निर्धारित किया जाना है । ऐसे गस (β-glucuronidase) या Luciferase के रूप में रिपोर्टर जीन का उपयोग विशेष रूप से कोशिकाओं है कि प्रभाव का निर्माण प्राप्त है भीतर जीन अभिव्यक्ति के संवेदनशील और मात्रात्मक माप की अनुमति देता है । उदाहरण के लिए, एक प्रभाव की शुरूआत एक प्रतिलेखन कारक एंकोडिंग का निर्माण TaABF15,6 स्थापित है कि HVA1 जैसे आबा-प्रेरित जीन TaABF1 द्वारा प्रेरित कर रहे हैं, जबकि GA प्रेरित जीन जैसे Amy32b दमित हैं । एक प्रयोगात्मक रणनीति के रूप में कण बमबारी GA/आबा संकेतन के विविध पहलुओं की जांच करने के लिए कई प्रयोगशालाओं द्वारा इस्तेमाल किया गया है । इस तरह के काम दोनों GA-प्रेरित2 और आबा-प्रेरित जीन3के सक्रियण के लिए महत्वपूर्ण प्रमोटर तत्वों की पहचान करने के लिए नेतृत्व किया है, और प्रोटीन kinases की खोज करने के लिए4 और प्रतिलेखन कारकों5 कि विनियमित इन जीनों की अभिव्यक्ति ।
मौजूदा प्रोटोकॉल2,3,4,5,6 कण बमबारी और क्षणिक जीन अभिव्यक्ति के बाद के माप के लिए काफी परिश्रम गहन हैं, बमबारी के प्रत्येक सेट के रूप में बमुश्किल अनाज एक मोर्टार और मूसल में हाथ से homogenized है और एंजाइम परख व्यक्तिगत रूप से किया जाता है । इस पांडुलिपि एक बेहतर प्रोटोकॉल है कि आंशिक रूप से स्वचालित बनाता है और homogenization कदम और गस परख को कारगर बनाने के लिए काफी अधिक प्रवाह की अनुमति रिपोर्ट, उपचार की एक बड़ी संख्या में अनुमति के लिए एक ही प्रयोग में परीक्षण किया है, और/ अधिक सांख्यिकीय मजबूत परिणाम प्राप्त करने के लिए प्रत्येक उपचार के लिए अधिक प्रतिकृति का समावेश । प्रतिनिधि परिणाम HVA1 और Amy32b रिपोर्टर का निर्माण, प्रतिलेखन कारक TaABF1 के रूप में के रूप में अच्छी तरह से GA, आबा, और अंय विनियामक अणुओं द्वारा विनियमित की अभिव्यक्ति के लिए दिखाए जाते हैं ।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रभाव जीन का परिचय कण बमबारी के माध्यम से constructs, रिपोर्टर के क्षणिक अभिव्यक्ति के बाद constructs GA/में विशेष अभिनेताओं की भूमिका को विच्छेदन के लिए एक बहुमूल्य रणनीति है संकेतन और परिणामस्वरूप हार्मोन विनियम…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक Greyson बटलर और मार्गरेट बैरेट को बाहर प्रयोगों, अनाज homogenization पर सलाह के लिए पत्थर से लगा हुआ, और fluorometry पर सलाह के लिए लिन Hannum ले जाने में मदद के लिए धंयवाद । यह काम राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (आइओबी ०४४३६७६) द्वारा समर्थित किया गया था, एक संस्थागत विकास पुरस्कार से (आइडिया) राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के जनरल मेडिकल साइंसेज के अनुदान संख्या P20GM0103423 के तहत, और से अनुदान द्वारा कोल्बी कॉलेज प्राकृतिक विज्ञान के प्रभाग ।
Materials
| GeneElute HP plasmid Maxiprep kit | Sigma | NA0310-1KT | |
| UV-vis spectrophotometer | Nanodrop | ND-1000 | |
| Himalaya barley grains | / | / | A variety of hulless barley (store in the dark at 4° C) |
| sodium succinate | Sigma | S2378 | Reagent for Imbibing Solution |
| calcium chloride (dihydrate) | Fisher | C79-500 | Reagent for Imbibing Solution |
| Imbibing Solution | home made | / | 20 mM sodium succinate, 20 mM calcium chloride, pH 5.0. Sterilize by autoclaving before use. |
| chloramphenicol | Sigma | C0378 | Prepare a 10 mg/mL stock solution in 70% ethanol. |
| vermiculite | Fisher | NC0430369 | Used for vermiculite plates. |
| filter paper circles (90 mm) | Whatman | 1001 090 | Used for vermiculite and for pre-bombardment grain preparation |
| Vermiculite Plates | home made | / | Add 50 mL of vermiculite to a glass petri dish. Place a 90 mm paper circle on top of the vermiculite. Autoclave. |
| forceps (fine pointed) | Fisher | 13-812-42 | Used for removing seed coat from barley grains. |
| forceps (ultra fine point) | Fisher | 12-000-122 | Used for removing seed coat from barley grains. |
| gold microcarriers (1.6 μm) | BioRad | 1652264 | |
| macrocarriers | BioRad | 1652335 | |
| calcium chloride (dihydrate) | Fisher | C79-500 | Prepare a 2.5 M stock solution and store 1 mL aliquots at -20° C. |
| spermidine | Sigma | S0266 | Prepare a 100 mM stock solution and store 500 μL aliquots at -20° C (use within 2 months). |
| rupture discs (1550 psi) | BioRad | 1652331 | |
| stopping screens | BioRad | 1652336 | |
| macrocarrier holders | BioRad | 1652322 | |
| Biolistic particle delivery system | BioRad | PDS-1000/He | |
| sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2 |
| sodium phosphate dibasic | Sigma | S9763 | Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2 |
| 1M sodium phosphate pH 7.2 | home made | / | Combine 6.9 g of sodium phosphate monobasic monohydrate with 7.1 g of sodium phosphate dibasic. Add water to 100 mL. Add NaOH to get pH 7.2. |
| dithiothrietol (DTT) | Sigma | 43819 | Dissolve in water to 1 M. Store at -20° in 1 mL aliquots. |
| leupeptin | Sigma | L2884 | Dissolve in water to 10 mg/mL. Store at -20° C. |
| glycerol | Sigma | G5516 | Prepare a 50% solution in water. |
| Grinding Buffer | home made | / | Combine 10 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 500 μL of 1 M DTT, 100 μL of 10 mg/mL leupeptin, and 40 mL of 50% glycerol. Add water to 100 mL. |
| stainlesss steel beads (5 mm) | Qiagen | 69989 | |
| 2.0 mL tubes | Eppendorf | 22363352 | This specific model of tube is recommended for use with the homogenizer. |
| bead homogenizer (TissueLyser) | Qiagen | 85210 | |
| 12mm x 75 mm glass test tubes | Fisher | ||
| luciferin | Goldbio | LUCK-100 | Prepare a 25 mM stock solution and store 1 mL aliquots at -20° C. |
| ATP | Sigma | A7699 | Prepare a 100 mM stock solution and store 250 μL aliquots at -20° C. |
| Tris base | Sigma | T1503 | Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7. |
| sulfuric acid | Sigma | 258105 | Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7. |
| 1M Tris sulfate pH 7.7 | home made | / | Dissolve 12.1 g Tris base in 100 mL of water. Adjust pH to 7.7 with sulfuric acid. |
| magnesium chloride | Sigma | M9397 | Dissolve in water to 2 M. |
| Luciferase Assay Buffer (LAB) | home made | / | Combine 3 mL of 1 M Tris sulfate pH 7.7, 500 μL of 2 M magnesium chloride, 1 mL of 1 M DTT, and 200 μL of 0.5 M EDTA. Add water to 50 mL. |
| Luciferase Assay Mixture | home made | / | Combine 15 mL of LAB, 800 μL of 25 mM luciferin, 200 μL of 100 mM ATP, and 4 mL of water. This makes enough assay mixture (20 mL) for 100 luciferase assays. |
| luminometer (Sirius) | Berthold | / | |
| 4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide (MUG) | Goldbio | MUG1 | Dissolve in DMSO to 100 mM. |
| sodium azide | Sigma | S8032 | Prepare a 2% stock solution in water and store 1 mL aliquots at -20° C. |
| 96 well plates (standard) | Fisher | 12565501 | |
| GUS assay buffer | home made | / | Combine 2.5 mL of MUG, 5 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 400 μL of 0.5 M EDTA, 1 mL of 1 M DTT, 100 μL of 10 mg/ml leupeptin, 20 mL of methanol, and 1 mL of 2% sodium azide. Add water to 100 mL. |
| TempPlate sealing film | USA Scientific | 2921-1000 | |
| 96 well plates (black) | Costar | 3916 | |
| sodium carbonate | Sigma | S7795 | Prepare a 200 mM solution in water. |
| 4-methylumbelliferone | Sigma | M1381 | Prepare a 100 μM solution in water. Freeze 1 mL aliquots at -20° C. |
| microplate fluouresence reader | Bio-Tek | FLX-800 |
References
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