Espressione genica in strati di Aleurone orzo bombardati con aumento della velocità di misura
Summary
Un protocollo migliore è presentato per la misura dell’espressione genica transitoria da costruzioni del reporter in cellule di aleurone di orzo dopo il bombardamento di particelle. La combinazione di grano automatizzato rettifica con analisi dell’enzima piastra a 96 pozzetti fornisce throughput elevato per la procedura.
Abstract
Lo strato aleuronico di chicchi d’orzo è un importante sistema modello per l’espressione di gene ormone-regolato nelle piante. In cellule di aleurone, geni richiesti per la germinazione o lo sviluppo iniziale del semenzale attivati da gibberelline (GA), mentre i geni associati con le risposte di sforzo sono attivati da acido abscissico (ABA). I meccanismi di segnalazione GA e ABA possono essere interrogati dall’introduzione di costruzioni di gene del reporter in cellule di aleurone via bombardamento di particelle, con l’espressione transitoria risultante misurata mediante analisi dell’enzima. Un protocollo migliorato è segnalato che parzialmente automatizza e semplifica il passaggio di omogeneizzazione di grano e l’analisi dell’enzima, che consente una velocità effettiva significativamente maggiore rispetto ai metodi esistenti. Omogeneizzazione dei campioni grano viene effettuata utilizzando un omogeneizzatore automatizzato del tessuto, e GUS (β-glucuronidasi) le analisi sono effettuate utilizzando un sistema di piastra a 96 pozzetti. Risultati rappresentativi utilizzando il protocollo suggeriscono che l’attività della fosfolipasi D può svolgere un ruolo importante nell’attivazione dell’espressione genica di HVA1 di ABA, attraverso il fattore di trascrizione TaABF1.
Introduction
Lo strato aleuronico orzo è un sistema consolidato modello per lo studio dell’espressione di gene ormone-regolato in piante1. In particolare, un numero di geni richiesti per la germinazione o lo sviluppo iniziale del semenzale è attivato da gibberelline (GA), mentre i geni associati con le risposte di sforzo sono attivati da acido abscissico (ABA). La GA e ABA vie di segnalazione sono intrecciate, come l’espressione di alcuni geni attivati dal GA è inibita da ABA e viceversa1.
Una strategia importante per comprendere che il ruolo degli attori particolari nella segnalazione di GA/ABA è stata l’introduzione di costrutti genici effettrici tramite bombardamento di particelle, seguita dall’espressione transitoria di costruzioni del reporter che consentono l’effetto risultante sul espressione genica a valle deve essere determinato. L’uso di geni reporter come GUS (β-glucuronidasi) o Luciferase permette la misura sensibile e quantitativa dell’espressione genica in particolare all’interno delle cellule che hanno ricevuto il costrutto dell’effettore. Ad esempio, l’introduzione di un costrutto di effettori che codifica per il fattore di trascrizione TaABF15,6 stabilito che geni indotti da ABA come HVA1 sono indotte da TaABF1, mentre GA-indotta di geni come Amy32b sono repressi. Bombardamento di particelle come una strategia sperimentale è stato utilizzato da più laboratori di approfondire diversi aspetti della GA/ABA segnalazione. Tale lavoro ha portato all’identificazione di elementi promotore importanti per l’attivazione indotta da GA2 sia geni indotti da ABA3e alla scoperta della proteina chinasi4 e fattori di trascrizione5 che regolano la espressione di questi geni.
Gli esistenti protocolli2,3,4,5,6 per bombardamento di particelle e successiva misura della espressione genica transitoria sono abbastanza laborioso, come ogni set di bombardato a malapena grani è omogeneizzato a mano in un mortaio e pestello e l’analisi dell’enzima sono effettuate individualmente. Questo manoscritto segnala un protocollo migliorato che parzialmente automatizza e semplifica il passaggio di omogeneizzazione e GUS saggi per consentire una velocità effettiva significativamente maggiore, permettendo un maggior numero di trattamenti da sottoporre all’esperimento stesso, e/o la inclusione di ulteriori repliche per ogni trattamento ottenere altri risultati statisticamente robusti. Risultati rappresentativi sono indicati per l’espressione di HVA1 e Amy32b costruzioni del reporter, regolata dal fattore di trascrizione TaABF1 nonché da GA, ABA e altre molecole regolatrici.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’introduzione del gene dell’effettore costrutti tramite bombardamento di particelle, seguita dall’espressione transitoria di costruzioni del reporter è una strategia importante per il ruolo degli attori particolari nella segnalazione di GA/ABA e nel gene ormone-regolata risultante di dissezione espressione.
Tuttavia, i protocolli esistenti per lo svolgimento di tali esperimenti in orzo aleuronico cellule2,3,4,<su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano Greyson Butler e Margaret Barrett per aiuto nello svolgere gli esperimenti, Judy Stone per consigli su omogeneizzazione di grano e Lynn Hannum per consigli su fluorometria. Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Science Foundation (IOB 0443676), di un premio per lo sviluppo istituzionale (IDeA) dal National Institute of General Medical Sciences, della National Institutes of Health, sotto concessione numero P20GM0103423 e da sovvenzioni da la divisione di Colby College di scienze naturali.
Materials
| GeneElute HP plasmid Maxiprep kit | Sigma | NA0310-1KT | |
| UV-vis spectrophotometer | Nanodrop | ND-1000 | |
| Himalaya barley grains | / | / | A variety of hulless barley (store in the dark at 4° C) |
| sodium succinate | Sigma | S2378 | Reagent for Imbibing Solution |
| calcium chloride (dihydrate) | Fisher | C79-500 | Reagent for Imbibing Solution |
| Imbibing Solution | home made | / | 20 mM sodium succinate, 20 mM calcium chloride, pH 5.0. Sterilize by autoclaving before use. |
| chloramphenicol | Sigma | C0378 | Prepare a 10 mg/mL stock solution in 70% ethanol. |
| vermiculite | Fisher | NC0430369 | Used for vermiculite plates. |
| filter paper circles (90 mm) | Whatman | 1001 090 | Used for vermiculite and for pre-bombardment grain preparation |
| Vermiculite Plates | home made | / | Add 50 mL of vermiculite to a glass petri dish. Place a 90 mm paper circle on top of the vermiculite. Autoclave. |
| forceps (fine pointed) | Fisher | 13-812-42 | Used for removing seed coat from barley grains. |
| forceps (ultra fine point) | Fisher | 12-000-122 | Used for removing seed coat from barley grains. |
| gold microcarriers (1.6 μm) | BioRad | 1652264 | |
| macrocarriers | BioRad | 1652335 | |
| calcium chloride (dihydrate) | Fisher | C79-500 | Prepare a 2.5 M stock solution and store 1 mL aliquots at -20° C. |
| spermidine | Sigma | S0266 | Prepare a 100 mM stock solution and store 500 μL aliquots at -20° C (use within 2 months). |
| rupture discs (1550 psi) | BioRad | 1652331 | |
| stopping screens | BioRad | 1652336 | |
| macrocarrier holders | BioRad | 1652322 | |
| Biolistic particle delivery system | BioRad | PDS-1000/He | |
| sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2 |
| sodium phosphate dibasic | Sigma | S9763 | Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2 |
| 1M sodium phosphate pH 7.2 | home made | / | Combine 6.9 g of sodium phosphate monobasic monohydrate with 7.1 g of sodium phosphate dibasic. Add water to 100 mL. Add NaOH to get pH 7.2. |
| dithiothrietol (DTT) | Sigma | 43819 | Dissolve in water to 1 M. Store at -20° in 1 mL aliquots. |
| leupeptin | Sigma | L2884 | Dissolve in water to 10 mg/mL. Store at -20° C. |
| glycerol | Sigma | G5516 | Prepare a 50% solution in water. |
| Grinding Buffer | home made | / | Combine 10 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 500 μL of 1 M DTT, 100 μL of 10 mg/mL leupeptin, and 40 mL of 50% glycerol. Add water to 100 mL. |
| stainlesss steel beads (5 mm) | Qiagen | 69989 | |
| 2.0 mL tubes | Eppendorf | 22363352 | This specific model of tube is recommended for use with the homogenizer. |
| bead homogenizer (TissueLyser) | Qiagen | 85210 | |
| 12mm x 75 mm glass test tubes | Fisher | ||
| luciferin | Goldbio | LUCK-100 | Prepare a 25 mM stock solution and store 1 mL aliquots at -20° C. |
| ATP | Sigma | A7699 | Prepare a 100 mM stock solution and store 250 μL aliquots at -20° C. |
| Tris base | Sigma | T1503 | Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7. |
| sulfuric acid | Sigma | 258105 | Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7. |
| 1M Tris sulfate pH 7.7 | home made | / | Dissolve 12.1 g Tris base in 100 mL of water. Adjust pH to 7.7 with sulfuric acid. |
| magnesium chloride | Sigma | M9397 | Dissolve in water to 2 M. |
| Luciferase Assay Buffer (LAB) | home made | / | Combine 3 mL of 1 M Tris sulfate pH 7.7, 500 μL of 2 M magnesium chloride, 1 mL of 1 M DTT, and 200 μL of 0.5 M EDTA. Add water to 50 mL. |
| Luciferase Assay Mixture | home made | / | Combine 15 mL of LAB, 800 μL of 25 mM luciferin, 200 μL of 100 mM ATP, and 4 mL of water. This makes enough assay mixture (20 mL) for 100 luciferase assays. |
| luminometer (Sirius) | Berthold | / | |
| 4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide (MUG) | Goldbio | MUG1 | Dissolve in DMSO to 100 mM. |
| sodium azide | Sigma | S8032 | Prepare a 2% stock solution in water and store 1 mL aliquots at -20° C. |
| 96 well plates (standard) | Fisher | 12565501 | |
| GUS assay buffer | home made | / | Combine 2.5 mL of MUG, 5 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 400 μL of 0.5 M EDTA, 1 mL of 1 M DTT, 100 μL of 10 mg/ml leupeptin, 20 mL of methanol, and 1 mL of 2% sodium azide. Add water to 100 mL. |
| TempPlate sealing film | USA Scientific | 2921-1000 | |
| 96 well plates (black) | Costar | 3916 | |
| sodium carbonate | Sigma | S7795 | Prepare a 200 mM solution in water. |
| 4-methylumbelliferone | Sigma | M1381 | Prepare a 100 μM solution in water. Freeze 1 mL aliquots at -20° C. |
| microplate fluouresence reader | Bio-Tek | FLX-800 |
References
- Chen, K., An, Y. Q. C. Transcriptional responses to gibberellin and abscisic acid in barley aleurone. J. Integ. Plant Biol. 48, 591-612 (2006).
- Lanahan, M. B., Ho, T. H. D., Rogers, S. W., Rogers, J. C. A gibberellin response complex in cereal alpha-amylase gene promoters. Plant Cell. 4, 203-211 (1992).
- Shen, Q., Zhang, P., Ho, T. H. D. Modular nature of abscisic acid (ABA) response complexes; composite promoter units that are necessary and sufficient for ABA induction of gene expression. Plant Cell. 8, 1107-1119 (1996).
- Gómez-Cadenas, A., Zentella, R., Walker-Simmons, M. K., Ho, T. H. D. Gibberellin/abscisic acid antagonism in barley aleurone cells: site of action of the protein kinase PKABA1 in relation to gibberellin signaling molecules. Plant Cell. 13, 667-679 (2001).
- Johnson, R. R., Shin, M., Shen, J. Q. The wheat PKABA1-interacting factor TaABF1 mediates both abscisic acid-suppressed and abscisic acid-induced gene expression in bombarded aleurone cells. Plant Mol. Biol. 68, 93-103 (2008).
- Harris, L. J., Martinez, S. A., Keyser, B. R., Dyer, W. E., Johnson, R. R. Functional analysis of TaABF1 during abscisic acid and gibberellin signaling in aleurone cells of cereal grains. Seed Science Res. 23, 89-98 (2013).
- Shen, Q., Casaretto, J., Zhang, P., Ho, T. H. D. Functional definition of ABA-response complexes: the promoter units necessary and sufficient for ABA induction of gene expression in barley (Hordeum vulgare). Plant Mol. Biol. 54, 111-124 (2004).
- Ritchie, S., Gilroy, S. Abscisic acid signal transduction in the barley aleurone is mediated by phospholipase D activity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 2697-2702 (1998).
- Takemiya, A., Shimazaki, K. Phosphatidic acid inhibits blue light-induced stomatal opening via inhibition of protein phosphatase 1. Plant Physiol. 153, 1555-1562 (2010).
- Zou, X., Seeman, J. R., Neuman, D., Shen, Q. J. A WRKY gene from creosote bush encodes an activator of the abscisic acid signaling pathway. J. Biol. Chem. 279, 55770-55779 (2004).
- Ishibashi, Y., et al. Reactive oxygen species are involved in gibberellin/abscisic acid signaling in barley aleurone cells. Plant Physiol. 158, 1705-1714 (2012).
- Piskurewicz, U., et al. The gibberellic acid signaling repressor RGL2 inhibits Arabidopsis seed germination by stimulating abscisic acid synthesis and ABI5 activity. Plant Cell. 20, 2729-2745 (2008).
- Hong, J. Y., et al. Phosphorylation-mediated regulation of a rice ABA responsive element binding factor. Phytochemistry. 72, 27-36 (2011).
- Lopez-Molina, L., Mongrand, S., McLachlin, D. T., Chait, B. T., Chua, N. H. ABI5 acts downstream of ABI3 to execute an ABA-dependent growth arrest during germination. Plant J. 32, 317-328 (2002).
- Zhou, X., et al. SOS2-LIKE PROTEIN KINASE5, an SNF1-RELATED PROTEIN KINASE3-Type protein kinase, is important for abscisic acid responses in Arabidopsis through phosphorylation of ABSCISIC ACID-INSESENSITIVE5. Plant Physiol. 168, 659-676 (2015).
- Zong, W., et al. Feedback regulation of ABA signaling and biosynthesis by a bZIP transcription factor targets drought-resistance-related genes. Plant Physiol. 171, 2810-2825 (2016).
