Messung der Genexpression in bombardierten Gerste Aleuronschicht Schichten mit erhöhter Durchsatz
Summary
Eine verbesserte Protokoll ist für die Messung der transiente Genexpression von Reporter Konstrukte in Gerste Aleuronschicht Zellen nach Bombardement Teilchen vorgestellt. Die Kombination von automatisierten Getreide mahlen mit 96-Well-Platte Enzym-Assays bietet hohen Durchsatz für das Verfahren.
Abstract
Die Aleuronschicht Gerstenkörner ist ein wichtiges Modellsystem für Hormon-regulierten Genexpression in Pflanzen. In Aleuronschicht Zellen Gene benötigt zur Keimung oder frühe Sämling-Entwicklung werden aktiviert, indem Gibberellin (GA), während Gene zugeordnete Stressreaktionen durch Abscisic Säure (ABA) aktiviert werden. Die Mechanismen der GA und ABA Signalisierung können abgefragt werden, durch die Einführung von Reporter Genkonstrukte in Aleuronschicht Zellen über Teilchen-Bombardement, mit den daraus resultierenden transiente Expression mit Enzym-Assays gemessen. Eine verbesserte Protokoll wird berichtet, dass teilweise automatisiert und rationalisiert das Korn Homogenisierung Schritt und die Enzym-Assays, wodurch deutlich mehr Durchsatz als bestehende Methoden. Homogenisierung der Getreide Proben erfolgt über eine automatisierte Gewebe-Homogenisator und GUS (β-Glucuronidase) Assays werden mit Hilfe einer 96-Well-Platte-System durchgeführt. Repräsentative Ergebnisse über das Protokoll legen nahe, dass Phospholipase D Tätigkeit eine wichtige Rolle bei der Aktivierung der HVA1 Genexpression von ABA, durch den Transkriptionsfaktor TaABF1 spielen kann.
Introduction
Die Aleuronschicht Gerste ist eine gut etablierte Modellsystem für das Studium der Hormon-regulierten Genexpression in Pflanzen1. Insbesondere werden eine Reihe von Genen, die für die Keimung oder frühe Sämling-Entwicklung durch Gibberellin (GA), aktiviert, während Gene zugeordnete Stressreaktionen durch Abscisic Säure (ABA) aktiviert werden. GA und ABA Signalwege sind miteinander verflochten, wie der Ausdruck einiger GA-aktivierten Gene von ABA und umgekehrt1gehemmt wird.
Eine sinnvolle Strategie für Verständnis, dass die Rolle von bestimmten Akteuren bei der Signalisierung GA/ABA wurde die Einführung der Effektor Genkonstrukte über Teilchen-Bombardement, gefolgt von transienten Expression Reporter Konstrukte, mit denen den daraus resultierende Effekt auf nachgeschalteten Genexpression bestimmt werden. Die Verwendung von Reporter-Gene wie GUS (β-Glucuronidase) oder Luciferase ermöglicht die sensible und quantitative Messung der Genexpression speziell innerhalb der Zellen, die die Effektor-Konstrukt erhalten haben. Zum Beispiel festgestellt die Einführung eines Effektor-Konstrukts Codierung der Transkriptionsfaktor TaABF15,6 , dass ABA-induzierten Genen wie HVA1 von TaABF1, beim GA-induzierten Genen wie Amy32b induziert werden werden unterdrückt. Teilchen-Bombardement als experimentelle Strategie wurde von mehreren Labors untersuchen verschiedene Aspekte des GA/ABA Signalisierung verwendet. Diese Arbeit führte zur Identifizierung der Promotor Elemente wichtig für die Aktivierung des GA-induzierte2 und ABA-induzierten Genen3und zur Entdeckung von Protein Kinasen4 und Transkription Faktoren5 , die Regeln der Expression dieser Gene.
Die vorhandenen Protokolle2,3,4,5,6 für Teilchen-Bombardement und Folgebewertung von transiente Genexpression sind sehr arbeitsintensiv, wie jede Gruppe von bombardiert kaum Getreide wird von Hand in einem Mörser und Stößel homogenisiert und die Enzym-Assays werden individuell durchgeführt. Diese Handschrift berichtet eine verbesserte Protokoll, das teilweise automatisiert und rationalisiert die Homogenisierung Schritt und der GUS assays um deutlich mehr Durchsatz ermöglichen eine größere Anzahl von Behandlungen im gleichen Experiment getestet werden bei schönem und/oder die Aufnahme von mehr Wiederholungen für jede Behandlung mehr statistisch solide Ergebnisse zu erzielen. Repräsentative Ergebnisse sind für den Ausdruck von HVA1 und Amy32b Reporter Konstrukte, reguliert durch den Transkriptionsfaktor TaABF1 sowie GA, ABA und andere regulatorische Moleküle dargestellt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Einführung der Effektor gen konstruiert über Teilchen-Bombardement, gefolgt von transienten Expression Reporter Konstrukte ist eine sinnvolle Strategie für die Rolle von bestimmten Akteuren in GA/ABA Signalisierung und das daraus resultierende Hormon reguliert gen sezieren Ausdruck.
Allerdings sind die vorhandenen Protokolle für solche Experimente in Gerste Aleuronschicht Zellen2,3,4,5</su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Greyson Butler und Margaret Barrett für Hilfe bei der Durchführung der Experimente, Judy Stone für die Beratung über Korn Homogenisierung und Lynn Hannum für Beratung bei Fluorometry. Diese Arbeit wurde von der National Science Foundation (IOB 0443676), durch eine institutionelle Development Award (IDeA) aus dem National Institute of General Medical Sciences von den National Institutes of Health unter Grant-Nummer P20GM0103423 und durch Zuschüsse unterstützt. die Colby College Division der Naturwissenschaften.
Materials
| GeneElute HP plasmid Maxiprep kit | Sigma | NA0310-1KT | |
| UV-vis spectrophotometer | Nanodrop | ND-1000 | |
| Himalaya barley grains | / | / | A variety of hulless barley (store in the dark at 4° C) |
| sodium succinate | Sigma | S2378 | Reagent for Imbibing Solution |
| calcium chloride (dihydrate) | Fisher | C79-500 | Reagent for Imbibing Solution |
| Imbibing Solution | home made | / | 20 mM sodium succinate, 20 mM calcium chloride, pH 5.0. Sterilize by autoclaving before use. |
| chloramphenicol | Sigma | C0378 | Prepare a 10 mg/mL stock solution in 70% ethanol. |
| vermiculite | Fisher | NC0430369 | Used for vermiculite plates. |
| filter paper circles (90 mm) | Whatman | 1001 090 | Used for vermiculite and for pre-bombardment grain preparation |
| Vermiculite Plates | home made | / | Add 50 mL of vermiculite to a glass petri dish. Place a 90 mm paper circle on top of the vermiculite. Autoclave. |
| forceps (fine pointed) | Fisher | 13-812-42 | Used for removing seed coat from barley grains. |
| forceps (ultra fine point) | Fisher | 12-000-122 | Used for removing seed coat from barley grains. |
| gold microcarriers (1.6 μm) | BioRad | 1652264 | |
| macrocarriers | BioRad | 1652335 | |
| calcium chloride (dihydrate) | Fisher | C79-500 | Prepare a 2.5 M stock solution and store 1 mL aliquots at -20° C. |
| spermidine | Sigma | S0266 | Prepare a 100 mM stock solution and store 500 μL aliquots at -20° C (use within 2 months). |
| rupture discs (1550 psi) | BioRad | 1652331 | |
| stopping screens | BioRad | 1652336 | |
| macrocarrier holders | BioRad | 1652322 | |
| Biolistic particle delivery system | BioRad | PDS-1000/He | |
| sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2 |
| sodium phosphate dibasic | Sigma | S9763 | Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2 |
| 1M sodium phosphate pH 7.2 | home made | / | Combine 6.9 g of sodium phosphate monobasic monohydrate with 7.1 g of sodium phosphate dibasic. Add water to 100 mL. Add NaOH to get pH 7.2. |
| dithiothrietol (DTT) | Sigma | 43819 | Dissolve in water to 1 M. Store at -20° in 1 mL aliquots. |
| leupeptin | Sigma | L2884 | Dissolve in water to 10 mg/mL. Store at -20° C. |
| glycerol | Sigma | G5516 | Prepare a 50% solution in water. |
| Grinding Buffer | home made | / | Combine 10 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 500 μL of 1 M DTT, 100 μL of 10 mg/mL leupeptin, and 40 mL of 50% glycerol. Add water to 100 mL. |
| stainlesss steel beads (5 mm) | Qiagen | 69989 | |
| 2.0 mL tubes | Eppendorf | 22363352 | This specific model of tube is recommended for use with the homogenizer. |
| bead homogenizer (TissueLyser) | Qiagen | 85210 | |
| 12mm x 75 mm glass test tubes | Fisher | ||
| luciferin | Goldbio | LUCK-100 | Prepare a 25 mM stock solution and store 1 mL aliquots at -20° C. |
| ATP | Sigma | A7699 | Prepare a 100 mM stock solution and store 250 μL aliquots at -20° C. |
| Tris base | Sigma | T1503 | Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7. |
| sulfuric acid | Sigma | 258105 | Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7. |
| 1M Tris sulfate pH 7.7 | home made | / | Dissolve 12.1 g Tris base in 100 mL of water. Adjust pH to 7.7 with sulfuric acid. |
| magnesium chloride | Sigma | M9397 | Dissolve in water to 2 M. |
| Luciferase Assay Buffer (LAB) | home made | / | Combine 3 mL of 1 M Tris sulfate pH 7.7, 500 μL of 2 M magnesium chloride, 1 mL of 1 M DTT, and 200 μL of 0.5 M EDTA. Add water to 50 mL. |
| Luciferase Assay Mixture | home made | / | Combine 15 mL of LAB, 800 μL of 25 mM luciferin, 200 μL of 100 mM ATP, and 4 mL of water. This makes enough assay mixture (20 mL) for 100 luciferase assays. |
| luminometer (Sirius) | Berthold | / | |
| 4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide (MUG) | Goldbio | MUG1 | Dissolve in DMSO to 100 mM. |
| sodium azide | Sigma | S8032 | Prepare a 2% stock solution in water and store 1 mL aliquots at -20° C. |
| 96 well plates (standard) | Fisher | 12565501 | |
| GUS assay buffer | home made | / | Combine 2.5 mL of MUG, 5 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 400 μL of 0.5 M EDTA, 1 mL of 1 M DTT, 100 μL of 10 mg/ml leupeptin, 20 mL of methanol, and 1 mL of 2% sodium azide. Add water to 100 mL. |
| TempPlate sealing film | USA Scientific | 2921-1000 | |
| 96 well plates (black) | Costar | 3916 | |
| sodium carbonate | Sigma | S7795 | Prepare a 200 mM solution in water. |
| 4-methylumbelliferone | Sigma | M1381 | Prepare a 100 μM solution in water. Freeze 1 mL aliquots at -20° C. |
| microplate fluouresence reader | Bio-Tek | FLX-800 |
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