Det här protokollet beskriver analys av blinkande yta-förbättrade Raman spridning på grund av den slumpmässig promenaden av en enda molekyl på en silver yta med power lagar.
Från en enda molekyl på en silver nanoaggregate junction observeras blinkande yta-förbättrade Raman spridning (SERS). Här, ett protokoll presenteras på hur du förbereder dem SERS aktiva silver nanoaggregate, spela in en video av vissa blinkande ställen i mikroskopiska bilden och analysera blinkande statistiken. I den här analysen återger en makt lag sannolikhetsfördelningar för ljusa händelser i förhållande till deras varaktighet. Sannolikhetsfördelningar för mörka händelser som monteras av en makt lag med en exponentiell funktion. Parametrarna för den makt lag representerar molekylär beteende både ljusa och mörka. Slumpmässig promenad modellen och hastigheten på molekylen över hela silver ytan kan uppskattas. Det är svårt att uppskatta även när du använder medelvärden, autokorrelation funktioner och super-upplösning SERS imaging. I framtiden bör makt lag analyser kombineras med spectral imaging, eftersom ursprunget till blinkar inte kan bekräftas genom denna analysmetod ensam.
Surface-förbättrade Raman spridning (SERS) är mycket känsliga Raman-spektroskopi från en noble metallyta. Eftersom Raman spektrumet innehåller detaljerad information om molekylär struktur som bygger på de vassa topp positionerna, genom de vibrationella lägen av funktionella grupper i molekylerna, kan informationen av en enda molekyl på en metallyta undersökas med SERS1,2,3. Från en silver nanoaggregate med en adsorbate på nivån singel-molekyl observeras en blinkande signal1,2,3,4,5,6, 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16och spektrumet fluktuerar1,2,3,4,5,6,7,8, 9,10,11,12,13,14. Blinkar kan induceras av en enda molekyl som slumpmässigt flyttar in och ut ur ett förstärkt elektromagnetiska (EM)-fält vid en nanometer-storlek silver nanoaggregate korsning. Blinkande anses därför enkla bevis för singel-molekyl detektering, jämfört med en teknik som använder en Poisson-fördelningen av SERS stödnivåer och en bi-analyt2,3,17. De detaljerade mekanismerna av blinkande och fluktuerande spektrumet, vilket starkt kan beror på molekylära beteende på Ag ytan, är emellertid fortfarande kontroversiellt.
I tidigare studier, har blinkande SERS analyserats med hjälp av funktionen autokorrelation som kan beräkna diffusion koefficient och koncentrationen av molekyler rör sig in och ut ur en förbättrad EM fält12,13,14 . Dessutom har en normaliserad standardavvikelse poäng, vilket motsvarar instabilitet i den totala intensiteten, hämtats från tidsprofilen för signal15. Dock kan dessa analytiska tillvägagångssätt baseras på beteendet hos ett fåtal molekyler. Däremot i en super-upplösning imaging av blinkande SERS, kan singel-molekyl beteende i ett förstärkt EM-fält vara identifierade16. Men kan dessa tekniker få sådana parametrar endast i en förbättrad EM-fältet. Den slumpmässiga beteenden av en enda molekyl inom ett brett intervall (exempelvis i blinkande SERS) kan representeras som en makt lag i stället för en genomsnittlig4,5,6,7,8 ,9,10,11, liknar blinkande fluorescens från en enda semiconductor quantum dot (QD)18,19. Med hjälp av en makt lag analys4,5,6,7,8,9,10,11, molekylär beteende kan uppskattas både i ljusa staten (i fältet förbättrad EM) och mörka statligt10; det vill säga kan uppförandet av molekylen över silver yta uppskattas.
För denna teknik, är silver kolloidal nanoaggregates används4,5,6,7,8,9,10,11. Dessa nanoaggregates visar olika lokaliserade ytan plasmon resonans (LSPR) band som starkt påverkar förbättrade elektromagnetiska fält när de är glada över vissa våglängder. SERS-aktiva silver nanopartiklar finns i kolloidal suspension, och vissa data kan således omedelbart erhållas. När det gäller enkla nanostrukturer, som har specifika storlekar, former och arrangemang, kan LSPR beroendet av SERS blinkar dölja andra dependences7; nämligen om den bra eller dåligt nanostrukturen till LSPR används parametrar kommer att vara konstant, och de andra dependences döljs därför. Makt lagen analys har använts för att upptäcka olika beroenden av den blinkande SERS från silver kolloidal nanoaggregates4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11.
Från silver nanoaggregate korsningen avges SERS. Således behöver vi förbereda nanoaggregates i stället för kolloidala nanopartiklar, som är täckta med citrat anjoner. Silver aggregat bildas från saltningen ut effekten som skapas genom tillsats av poly-L-lysin, som har -NH3+ och är ursprunget till SERS, eller Na+ kationer från NaCl, som visas i Figur S2 av kompletterande material. Dessutom för att belysa de många ställena i området brett, levereras ofokusera…
The authors have nothing to disclose.
Författaren tack Prof. Y. Ozaki (Kwansei Gakuin University) och Dr. T. Itoh (nationella institutet för avancerad industriell vetenskap och teknik) för deras fruktbar diskussion av detta arbete. Detta arbete stöds av KAKENHI (bidrag för vetenskaplig forskning C) från ministeriet för utbildning, kultur, sport, vetenskap och teknik (nr 16K 05671).
Silver nitrate, 99.8% | Wako | 194-00832 | |
Trisodium citrate dihydrate, 99. % | Wako | 191-01785 | |
Poly-L-lysine aqueous solution, 0.1% | Sigma-Aldrich | P8920 | |
3,3'-disulfopropylthiacyanine triethylamine | Hayashibara Biochemical Laboratories | NK-2703 | a kind of thiacyanine dyes |
3,3'-diethyl-5,5'-dichloro-9-methylthiacarbocyanine iodine salt | Hayashibara Biochemical Laboratories | SMP-9 | a kind of thiacarobocyanine dyes |
Sodium chloride, 99.5% | Wako | 191-01665 | |
Dimroth condenser | Iwaki | 61-9722-22 | perchased from AS ONE |
Magnetic stirrer | Corning | DC-420D | |
Oil bath | Advantech | OS-220 | |
Glass plate | Matsunami | S-1112 | Microscope slide |
Blower | Hozan | Z-288 | Air duster |
Liquid blocker pen | Daido Sangyo | LIQUID BLOCKER (Super Pap Pen). Ready-to-use hydrophobic barrier pen designed for immunohistochemistry applications | |
Inverted microscope | Olympus | IX-70 | |
Objective lens | Olympus | LCPlanFl 60× | NA 0.7 |
Dark field condenser | Olympus | U-DCD | NA 0.8–0.92 |
Cooled digital CCD camera | Hamamatsu | ORCA-AG | controlled by software Aqua Cosmos |
Software for the cooled digital CCD camera | Hamamatsu | AquaCosmos | used for also derivation of the time-profiles from the blinking spots in the video |
Color CCD camera | ELMO | TNC-C920 | not used for analysis |
DPSS laser | RGB laser system | NovaPro532-75 | λ = 532 nm; 60 mW (corresponds to a power density of 600 W/cm2) |
Interference filter | Semrock | LL01-532-12.5 | |
Long pass filter | Semrock | BLP01-532R-25 | |
Software for the distinguishment and counting of the bright/dark events | home-maid | programmed by C++ | |
Software for the fitting by a power law | LightStone | Origin6.1 |