Arkitekturen av protein komplekser er nødvendig for sin funksjon. Kombinere ulike masse spectrometric teknikker vist seg kraftig å studere forsamlingen deres. Vi tilbyr protokoller for kjemiske cross-linking og innfødt massespektrometri og Vis hvordan disse utfyllende teknikker bidra til å belyse arkitektur multi delenhet protein samlinger.
Proteiner samhandle med deres ligander til skjemaet aktiv og dynamisk samlinger som utfører ulike cellulære funksjoner. Klargjørende disse interaksjonene er derfor grunnleggende for forståelsen av cellulære prosesser. Men mange protein komplekser er dynamiske samlinger og er ikke tilgjengelig med konvensjonelle strukturelle teknikker. Massespektrometri bidrar til strukturelle etterforskningen av disse samlingene, og spesielt kombinasjonen av ulike masse spectrometric teknikker gir verdifull innsikt i deres strukturelle arrangement.
I denne artikkelen vi beskriver programmet og kombinasjon av to utfyllende masse spectrometric teknikker, nemlig kjemiske cross-linking kombinert med massespektrometri og innfødt massespektrometri. Kjemisk cross-linking innebærer kovalente sammenhengen av aminosyrer i nærheten ved hjelp av kjemiske reagenser. Etter fordøyelsen med proteaser, krysskoblet di-peptider identifiseres massespektrometri og protein interaksjoner nettsteder er avdekket. Native massespektrometri er derimot analysen av intakt protein samlinger i gassform av en masse spectrometer. Det avslører protein stoichiometries som protein og ligand interaksjoner. Begge teknikkene derfor gir utfyllende informasjon om strukturen i protein-ligand samlinger og kombinasjonen vist seg kraftig i tidligere studier.
Strukturelle etterforskningen av protein samlinger har blitt spesielt viktig for forståelsen av cellulære prosesser. Følgelig er mange teknikker utviklet og forbedret i strukturell biologi1. Men er disse teknikkene noen ganger begrenset i sitt program på grunn av størrelse, fleksibilitet eller heterogenitet protein komplekser under etterforskning. Massespektrometri kan håndtere disse utfordringene, og derfor dukket opp som et kraftig verktøy i strukturell biologi2,3,4,5. Den største fordelen av massespektrometri, er imidlertid muligheten til å entydig identifisere proteiner i komplekse og heterogene blandinger6. Dette proteiner er vanligvis fordøyd med endoproteinases og resulterende peptid blandingen er atskilt med flytende kromatografi og direkte elut i masse spectrometer. Peptid massene bestemmes senere og forløper ioner velges for ytterligere fragmentering av peptider. Proteiner identifiseres deretter søker peptid og tilsvarende fragment massene mot en kjent database. Denne prosedyren ikke bare lar identifikasjon av peptider/proteiner, men også deres post-translasjonell endringer som forårsaker en masse forskyvning av forløperen peptider og fragment ioner bærer endring7. Noen av de mange teknikkene i strukturelle massespektrometri er basert på dette prinsippet4,8. For eksempel fot merking teknikker som hydrogen deuterium exchange9,10, kjemiske merking strategier11,12eller hydroksyl radikale utskrift13,14 , gir innsikt i overflaten tilgjengelighet av proteiner under visse betingelser.
En annen teknikk er (kjemisk) cross-linking involverer kovalente sammenhengen av aminosyrer i nærheten gjennom deres funksjonelle grupper. For dette er kjemiske reagenser, UV-activatable reagenser eller aminosyrer ansatt15,16. Etter cross-linking, proteiner er vanligvis hydrolyzed med proteaser og krysskoblet di-peptider analyseres av flytende kromatografi-kombinert massespektrometri. Identifikasjon av cross-linking produkter av database søker, men krever bruk av spesialisert programvare som sammenhengende peptid sekvenser av ulike proteiner og ulike regioner17,18,19. Bruk av kjemiske cross-linkers har fordelen at det kan brukes til nesten alle protein kompleks av interesse og krever ikke innlemmelse av UV-activatable aminosyrer, som bare kan nås når uttrykke protein interesse vertsceller. Slik cross-linking er et allsidig verktøy og var vellykket ansatt i mange strukturelle studier selv store protein samlinger20.
Massespektrometri av intakt protein komplekser (også kalt “native” massespektrometri), derimot, omfatter analyse av intakt proteiner og protein komplekser uten hydrolyse i peptider. Det avslører komposisjon, heterogenitet, støkiometri, topologi og delenhet interaksjoner protein komplekser21,22. I kombinasjon med ion mobilitet lar innfødt massespektrometri videre fastsettelse av deres konformasjon23,24. Dette gjør det et kraftig verktøy for strukturelle etterforskningen av protein komplekser som er vanskelig å vurdere av konvensjonelle strukturelle teknikker. Native massespektrometri krever imidlertid analyse buffere som opprettholde ikke-kovalente protein interaksjoner under electrospray ionisering. Dette oppnås vanligvis ved hjelp av vandig, flyktige buffere som ammonium acetate25. I tillegg er instrument endringer nødvendig for å hindre dissosiasjon under overføring i gassform masse spectrometer26. Brukt på denne måten, ble mange (stor) protein komplekser analysert. Imponerende eksempler er studiene intakt ribosomer27, ATP synthases28eller virus29.
Kombinasjonen av innfødte massespektrometri og cross-linking vist på tidligere studier. For eksempel stoichiometries av Anstandsdame komplekser, inkludert en uventet Hsp70 dimer, kan hentes fra massespektrometri eksperimenter av intakt protein komplekser, mens kjemiske cross-linking avslørt arrangementer av proteiner i den samlinger30,31. I en annen studie, ble effekter av post-translasjonell modifikasjoner på en intakt ATP syntase komplekse studert. Native massespektrometri gitt innsikt i protein kompleks stabiliteten i tilstedeværelse eller fravær av fosforylering eller acetylation32,33. En komparativ cross-linking strategi34 da avslørt conformational endringer av proteinet under forskjellige betingelser.
Her gir vi protokollene for protein identifikasjon av massespektrometri, (kjemisk) cross-linking og innfødt massespektrometri, inkludert dataanalyse og fortolkning (figur 1). Kombinasjonen av utfyllende resultatene fra disse metodene med hjelp av to godt karakterisert protein komplekser er demonstrert35. Våre protokollen kan brukes til alle protein samling som kan renses på visse renhet og konsentrasjon. Tilnærmingen er i noen tilfeller begrenset av data analysen av cross-linking data, dvs., størrelsen på databasen ansatt, som bestemmer de nødvendige søke plass og tid. I tillegg manualen godkjenningen av identifiserte cross-links er ofte nødvendig og ytterligere reduserer produksjonen. Innfødt massespektrometri er stort sett begrenset av prøven kvalitet, f.eks, buffere og addukter brukes under rensing og muligheten til å utveksle dem av vandige og flyktige buffere. Protein komplekser renset for strukturell analyse vanligvis har imidlertid kvaliteten kreves for vellykket analyse med våre protokoller.
Protokoller gis for masse massespektrometri-baserte strukturelle analyser av flere delenhet protein komplekser. De to teknikkene, beskrevet i protokollen, hovedsakelig gir utfyllende resultater og er godt egnet til å få innsikt i de strukturelle ordningene innenfor protein (-ligand) komplekser som er vanskelig å studere av konvensjonelle strukturelle teknikker. Native massespektrometri gir innsikt i protein stoichiometries samt protein interaksjoner ved å analysere subcomplexes og stabil samhandling moduler. Cross-Linking, derimot, gir informasjon om direkte kontakt nettsteder. Avhengig av kryss-linker brukes, en viss fleksibilitet kan eller bør inkluderes i analysen.
De angitte protokollene er generelt lett å utføre og ikke tidkrevende. Hele protokollen kan utføres innen en uke og kan brukes til nesten alle protein komplekser, selv om en viss proteinet er nødvendig for vellykket analyse. Eksempel forberedelse er enkelt og krever ikke spesielt renset protein komplekser. Men er en vanlig fallgruve forurensning av prøven under eksempel forberedelse for masse massespektrometri-basert protein identifikasjon. Disse forurensing i de fleste tilfeller inkluderer keratins som stammer fra støv, hud og hår. Derfor ekstra forsiktighet som seg hansker og labfrakker, filtrerende egenskaper vandig buffere, og bruker høy renhetsgrad løsemidler bør tas under eksempel forberedelse for masse massespektrometri-basert protein identifikasjon. Andre skadelige proteiner som chaperones er vanligvis introdusert under protein rensing, f.eksved affinitet koder. I disse tilfellene bør protein rensing forbedres, for eksempel ved å øke vask trinnene. I alle fall protein forurensing i utvalget er lett identifiseres under databasen søket ved å utelate taksonomi filteret (dvs.søke mot proteiner fra alle arter). Hvis bare noen peptider er observert (dvs.en lav protein dekning kan hente), selv om tilstrekkelig utvalg er tilgjengelig, kan det være nødvendig å bruke en annen proteinasen under fordøyelsen. Generelt gir Trypsin et tilstrekkelig antall peptider; men i noen tilfeller som membran proteiner eller membran domener av proteiner, antall tryptic cleavage områder reduseres og andre enzymer målretting hydrofobe aminosyrer er et bedre valg.
Når det gjelder instrumentering kreves en spesielt modifisert instrument for native massespektrometri som opprettholder ikke-kovalente interaksjoner under overføring i gassform. Flere apparattyper er innført, inkludert Q-ToF og orbitrap instrumenter. Mens endret Q-ToF masse spektrometre er kommersielt tilgjengelig for opprinnelige massespektrometri siden flere år, sistnevnte ble nylig introdusert og i de fleste tilfeller krever spesialisert endring45. Men anvendelsen av høyoppløselige instrumenter tillatt studere binding av flere ligander og deres kvantifisering46,47 og er lovende for framtidige applikasjoner.
For å identifisere krysskoblet di-peptider av flytende kromatografi-kombinert massespektrometri, brukes standard prosedyrer med noen modifikasjoner. Databasen søket er imidlertid den begrensende faktoren som spesialisert programvare kan sjelden håndtere store databaser, og redusert databaser som inneholder protein underenheter av komplekser kreves. Nyere studier brukt masse massespektrometri-cleavable cross-linkers målretting protein interaksjoner i hele cellen lysates48,49. Bruk av kjemiske cross-linkers som fragmentere tandem massespektrometri eksperimenter hovedsakelig gir lineær peptider (endret av kryss-linker) som kan identifiseres ved ytterligere fragmentering og databasen søker av lineær peptider, og dette reduserer søke tid og beregningsorientert søke plass. Men for å utføre disse eksperimentene, er en ion felle masse analyserer eller en hybrid masse spectrometer med en ion felle nødvendig. Generelt falske positiver er en viktig sak, valideres masse spektra av krysskoblet peptider ofte manuelt av kvaliteten av deres fragment spektra som strekker data analyse tid enormt. Utvikle robust scoring systemer som kan brukes uten ytterligere validering trinnene er derfor potensielle fremtidige anvendelser. En måte å forbedre dataanalyse og redusere antall falske positiver var innføringen av falske oppdagelsen rate beregninger og deres anvendelse til cross-linking datasett50.
Generelt, teknikerne beskrevet her kan suppleres med ytterligere massespektrometri teknikker (f.ekskovalente merking) øke utdataene fra analysen. Andre endringer og forbedringer av protokollene kan enkelt implementeres. Slik unravels sammenlignende cross-linking34 conformational endringer i samlingen protein. Videre utviklingen i native massespektrometri tillater i dag analyse av membran proteiner51,52 og deres samhandling med lipider28,52,53,54 . Ny bebyggelser av høyoppløselige masse spektrometre for native massespektrometri har utvidet programmet og ligand binding, f.eks, binding av lipider membran proteiner, kan nå inkluderes i analysen45, 46. i kombinasjon med beregningsorientert modellering tilnærminger, disse teknikkene kan levere strukturelle modeller av varierende oppløsning55. Hvis ingen krystall strukturer er tilgjengelig for de intakt komplisert eller enkelt underenheter, levere massespektrometri første innsikt i protein interaksjoner og topologien for ukjent komplekset. Avhengig av teknikkene som brukes og resultatene, finnes lav modeller av ukjent komplekset56,57,58. Hvis krystall strukturer eller homologi modeller er tilgjengelige, kan strukturelle informasjonen du mottok fra massespektrometri gi selv nær-innfødt modeller59.
Sammenlignet med andre strukturelle teknikker, massespektrometri har fordelen at det krever lite utvalg beløp, den kan håndtere heterogene prøver og gjelder protein komplekser av ubegrenset størrelse. I tillegg kan massespektrometri etterforskningen av dynamisk protein systemer. Forskjellige populasjoner av protein- eller proteinet som finnes i løsningen er vanligvis analysert sammen og derfor, i motsetning til med andre strukturelle teknikker som krever valg av bestemte befolkningsgrupper, alle konformasjonen opprettholdes under analyse og er assessable i ett eksperiment. Kvantitativ cross-linking tilnærminger ble nylig introdusert34,60,61 og er lovende for framtidige applikasjoner som beskriver conformational endringer under ulike forhold.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker våre kolleger for nyttig diskusjoner. Vi takker også Ilme Schlichting og Karl-Peter Hopfner for å gi protein komplekser. Vi erkjenner finansiering fra det føderale ministeriet for utdanning og forskning (BMBF, sikk program, 03Z22HN22), den europeiske Regional utvikling midler (EFRE, ZS/2016/04/78115) og den MLU Halle-Wittenberg CS og finansiering fra Wellcome Trust (109854/658 Z/15/Z) til A.P.
Chemicals, Reagents, Consumables | |||
2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma Aldrich | H4034 | buffer |
Acetic acid | Sigma Aldrich | 695092 | pH |
Acetonitrile Optima LC/MS | Fisher Chemicals | A955-1 | solvent |
Amicon Ultra centrifugal devices (different MWCO) | Millipore | i.e. UFC500396 | buffer exchange, concentration |
Ammonium acetate solution | Sigma Aldrich | A2706 | native MS |
Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 9830 | in-gel digestion |
Ammonium solution | Sigma Aldrich | 9859 | pH |
Bis(Sulfosuccinimidyl)suberate-d0 (BS3-d0) | Thermo Scientific | 21590 | cross-linker |
Bis(Sulfosuccinimidyl)suberate-d4 (BS3-d4) | Thermo Scientific | 21595 | cross-linker |
Caesium iodide | Sigma Aldrich | 203033 | calibration |
Calcium chloride | Sigma Aldrich | C5670 | in-gel digestion |
Capillaries (1.0 OD × 0.78 ID × 100 L mm) | Harvard Apparatus | 30-0038 | native MS |
Disuccinimidyl suberate (DSS) | Thermo Scientific | 21655 | cross-linker |
DL-Dithiothreitol | Sigma Aldrich | D5545 | in-gel digestion |
DMSO (dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | D8418 | solvent |
Ethanol | Fisher Chemicals | BP2818 | solvent |
Formic acid Optima LC/MS | Fisher Chemicals | A117-50 | solvent supplement |
Instant Blue Coomassie staining solution | expedeon | ISB1L | staining solution for gel electrophoresis |
Invitrogen NuPAGE 4-12% Bis-Tris gels (1 mm, 10 well) | life technologies | NP0323BOX | gel electrophoresis |
Iodoacetamide | Sigma Aldrich | I1149 | In-gel digestion |
Isopropyl alcohol, HPLC grade | Fisher Chemicals | P750717 | solvent |
Methanol | Fisher Chemicals | A456-212 | solvent |
Micro BioSpin 6 columns | BioRad | 732-6222 | buffer exchange |
NuPAGE Antioxidant | invitrogen | NP0005 | running buffer, gel electrophoresis |
NuPAGE LDS Sample Buffer (4 ×) | invitrogen | NP0007 | sample loading buffer (non-reducing) for gel electrophoresis |
NuPAGE MES SDS Running buffer | life technologies | NP0001 | gel electrophoresis |
NuPAGE MOPS SDS Running buffer | life technologies | NP0001 | gel electrophoresis |
NuPAGE Sample Reducing Agent (10 ×) | invitrogen | NP0004 | reducing Agent for gel electrophoresis |
PBS – phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P4417 | buffer |
SeeBlue Plus2 Prestained Standard Protein Marker | invitrogen | LC5925 | prestained Protein Marker for gel electrophoresis |
Sodium acetate | Sigma Aldrich | S2889 | ethanol precipitation |
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Sigma Aldrich | 252859 | buffer |
Trypsin | Sigma Aldrich | TRYPSEQ-RO (11418475001) | in-gel digestion |
Vivaspin centrifugal devices (different MWCO) | Sartorius | i.e. VS0101 | buffer exchange, concentration |
Water for HPLC | Sigma Aldrich | 270733-2.5L-M | solvent |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Instruments | |||
Centrifuge Heraeus Fresco 21, bench-top centrifuge | Thermo Scientific | 75002425 | |
Flaming / Brown Micropipette puller Model P-1000 | Sutter Instruments | P-1000 | |
Gelelectrophoresis chamber Xcell SureLock MiniCell | Invitrogen | EI0001 | |
Gold Coater Quorum Q150R S | Quorum Technologies Ltd. | Q150RS | |
Horizontal gel shaker Rotamax 120 T | Heidolph Instruments | 544-41200-00 | |
Q-TOF Ultima mass spectrometer, MS Vision high mass upgrade | Waters (Micromass) | – | |
reversed-phase C18 analytical column Acclaim PepMap (C18, 75 mm I.D., 50 cm, 3 mm pore size) | Thermo Scientific | 164570 | |
reversed-phase C18 pre-column (C18, 150 mm I.D., 2 cm, 5 mm pore size) | Thermo Scientific | 164213 | |
scalpel | Fisher Scientifc | 10463989 | |
SpeedVac SPD121P vacuum centrifuge | Thermo Scientific | SPD121DP-230 | |
Thermomixer C | Eppendorf | 5382000015 | |
Tweezers AA | Sigma Aldrich | Z680184-1EA | |
Ultrasonic cleaner USC-TH, sonication bath | VWR | 142-0084 | |
UltiMate Dionex 3000 nano-LC system, coupled to Q-Exactive plus hybrid mass spectrometer (nano-ESI source) | Thermo Scientific | 0726030+ | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software, Software Tools, Database search | |||
Mascot | www.matrixscience.com | ||
Massign | http://massign.chem.ox.ac.uk | ||
MassLynx | Micromass | ||
MassMatrix | Xu, H. J Proteome Res. 9 (2010) | ||
MaxQuant | Cox, J. Nat. Biotechn. 26 (2008) | ||
pLink | Yang, B. Nat Methods 9 (2012) | ||
pXtract conversion tool | http://pfind.ict.ac.cn/downloads.html | ||
UniDec | Marty, M.T. Anal. Chem. 87 (2015) | ||
XCalibur | Thermo Scientific | ||
XiNET | http://crosslinkviewer.org | ||
XLinkX | Liu, F. Curr Op Struct Biol 35 (2015) | ||
xQuest | Rinner, O. Nat Methods 5 (2008) | ||
Xvis | https://xvis.genzentrum.lmu.de |