Arkitekturen av proteinkomplex är avgörande för deras funktion. Kombinera olika massa spektrometriska tekniker visat kraftfull att studera deras församlingen. Vi tillhandahåller protokoll för kemiska cross-linking och infödda masspektrometri och visar hur dessa kompletterande tekniker hjälpa till att belysa arkitekturen av flera subenhet protein församlingar.
Proteiner interagerar med deras ligander till formuläret aktiva och dynamiska sammansättningar som utför olika cellulära funktioner. Belysa dessa interaktioner är därför grundläggande för förståelsen av cellulära processer. Men många proteinkomplex är dynamiska sammansättningar och kan inte nås av konventionella strukturella tekniker. Masspektrometri bidrar till strukturella undersökningen av dessa församlingar, och särskilt kombinationen av olika massa spektrometriska tekniker ger värdefulla insikter i deras strukturella arrangemang.
I den här artikeln beskriver vi ansökan och kombination av två kompletterande massa spektrometriska tekniker, nämligen kemiska cross-linking tillsammans med masspektrometri och infödda masspektrometri. Kemiska tvärbindningsmedel innebär kovalent sammanlänkningen av aminosyror i närheten med hjälp av kemiska reagenser. Efter uppslutning med proteaser, tvärbunden di-peptider identifieras av masspektrometri och protein interaktioner webbplatser är avtäckt. Infödda masspektrometri är däremot analysen av intakt protein församlingar i gasfas av en masspektrometer. Det avslöjar protein stoichiometries samt protein och ligand interaktioner. Båda teknikerna levererar därför kompletterande information om strukturen på protein-ligand sammansättningar och deras kombination visat sig vara kraftfulla i tidigare studier.
Strukturella undersökningen av protein aggregat har blivit särskilt viktigt för förståelsen av cellulära processer. Följaktligen har många, tekniker utvecklats och förbättrats i strukturbiologi1. Dessa tekniker är dock ibland begränsade sin ansökan på grund av storlek, flexibilitet eller heterogenitet av proteinkomplex under utredning. Masspektrometri kan ta itu med dessa utmaningar och därför växte fram som ett kraftfullt verktyg i strukturbiologi2,3,4,5. Den största fördelen med masspektrometri, är dock förmågan att otvetydigt identifiera proteiner även i komplexa och heterogena blandningar6. För detta ändamål proteiner rötas oftast med endoproteinases och den resulterande peptid blandningen separeras genom vätskekromatografi och direkt elueras in masspektrometer. Peptid massan bestäms därefter och föregångare joner väljs för ytterligare fragmentering av peptiderna. Proteiner är sedan identifierade genom forskande peptid och motsvarande fragment massorna mot en känd databas. Detta förfarande inte bara tillåter identifiering av peptider/proteiner men också deras post-translationella modifieringar som orsakar en massa förskjutning av föregångare peptiderna och fragment jonerna bär den ändring7. Några av de många teknikerna i strukturella masspektrometri bygger på denna princip4,8. Till exempel fot märkning tekniker såsom väte deuterium exchange9,10, kemisk märkning strategier11,12, eller hydroxyl radikala utskrift13,14 , ge insikter i ytan tillgängligheten av proteiner under vissa förutsättningar.
En annan teknik är (kemisk) cross-linking med kovalenta sammanlänkningen av aminosyror i närheten genom deras funktionella grupper. För detta är kemiska reagenser, UV-activatable reagenser eller aminosyror sysselsatta15,16. Efter bryggbindningen, proteinerna är vanligtvis hydrolyseras med proteaser och tvärbunden di-peptider analyseras av flytande kopplade kromatografi masspektrometri. Identifiering av bryggbindningen produkter av databasen söka, men kräver användning av specialiserad programvara som sammanfogar peptid sekvenser av olika proteiner och olika regioner17,18,19. Användning av kemiska cross-linkers har fördelen att den kan användas till nästan varje protein komplex av intresse och inte kräver införlivande av UV-activatable aminosyror, som bara kan uppnås när uttrycker proteinet av intresse i värdceller. Som sådan, cross-linking är ett mångsidigt verktyg och användes framgångsrikt i många strukturella studier även stora protein aggregat20.
Masspektrometri av intakt proteinkomplex (kallas ibland ”inhemska” masspektrometri), å andra sidan, innebär analys av intakta proteiner och proteinkomplex utan hydrolys i peptider. Det avslöjar sammansättning, heterogenitet, stökiometri, topologi och subunit interaktioner protein komplex21,22. I kombination med ion rörlighet gör infödda masspektrometri ytterligare bestämning av deras konformation23,24. Detta gör det ett kraftfullt verktyg för strukturella utredning av proteinkomplex som är svåra att bedöma av konventionella strukturella tekniker. Infödda masspektrometri kräver dock analys buffertar som upprätthåller icke-kovalenta proteininteraktioner under elektrospray jonisering. Detta uppnås vanligen med hjälp av vattenhaltigt, flyktiga buffertar såsom ammonium acetat25. Ändringar av instrumentet är dessutom nödvändiga för att förhindra dissociation under överföringen till gasfas av masspektrometer26. Tillämpas på detta sätt, analyserades många (stor) proteinkomplex. Imponerande exempel är studier av intakt ribosomer27, ATP syntaser28eller virus29.
Kombinationen av infödda masspektrometri och cross-linking visat sig särskilt framgångsrik i tidigare studier. Exempelvis stoichiometries av förkläde komplex, inklusive en oväntad Hsp70 dimer, kunde erhållas från masspektrometri experiment av intakt proteinkomplex, medan kemiska cross-linking avslöjade arrangemangen av proteinerna i den församlingar30,31. I en annan studie studerades effekterna av post-translationella modifieringar på en intakt ATP synthase komplexa. Infödda masspektrometri finns insikter i protein komplex stabiliteten i närvaro eller frånvaro av fosforylering eller acetylering32,33. En jämförande tvärbindande strategi34 avslöjade sedan konfirmerande förändringar av protein komplex på olika villkor.
Här ger vi protokollen för protein identifiering av masspektrometri (kemisk) cross-linking och infödda masspektrometri, inklusive dataanalys och tolkning (figur 1). Kombinationen av kompletterande resultat från dessa metoder med hjälp av två välkarakteriserad proteinkomplex är påvisad35. Våra protokoll kan tillämpas på någon protein församling som kan renas vid vissa renhet och koncentration. Metoden är i vissa fall begränsas av dataanalys av cross-linking data, dvs, storleken på databasen anställd, som bestämmer tid och det krävs Sök. Dessutom manuell validering av identifierade tvärbindningar krävs ofta och ytterligare minskar produktionen. Infödda masspektrometri begränsas främst av provet kvaliteten, t.ex., buffertar och addukter används under rening och möjligheten för att utbyta dem av vattenfasen och flyktiga buffertar. Proteinkomplex som renas för strukturanalys vanligtvis har dock den kvalitet som krävs för framgångsrik analys med våra protokoll.
Protokoll finns för mass spectrometry-baserade strukturanalys av flera subenhet proteinkomplex. Två metoder, som beskrivs i protokollet, mestadels leverera kompletterande resultat och är väl lämpade att få insikter i de strukturella arrangemangen inom protein (-ligand) komplex som är svåra att studera genom konventionella strukturella tekniker. Infödda masspektrometri levererar insikter i protein stoichiometries samt proteininteraktioner genom att analysera subcomplexes och stabil interaktion moduler. Bryggbindningen, däremot, ger information på direkt kontakt webbplatser. Beroende på den cross-linker används, en viss flexibilitet kan eller bör ingå i analysen.
De medföljande protokoll är i allmänhet lätt att utföra och inte tidskrävande. Hela protokollet kan utföras inom en vecka och kan tillämpas på nästan alla proteinkomplex, även om en viss mängd protein komplex krävs för framgångsrika analysen. Provberedning är enkel och kräver inte speciellt renat proteinkomplex. En vanlig fallgrop är dock kontaminering av provet under provberedning för mass spectrometry-baserade protein identifiering. Dessa föroreningar i de flesta fall inkluderar keratins som påbörjar från damm, hud eller hår. Därför extra vård som bär handskar och lab rockar, filtrerande aqueous buffertar, och med hjälp av hög renhet lösningsmedel bör tas under provberedning för mass spectrometry-baserade protein identifiering. Andra kontaminerande proteiner såsom chaperones införs oftast under protein rening, t.ex., när du använder affinitet taggar. I dessa fall bör protein rening förbättras, exempelvis genom att öka tvätt steg. I varje fall protein föroreningar i provet lätt identifieras under databas sökningen genom att utelämna filtret taxonomi (dvssöka mot proteiner från alla arter). Om bara några peptider observeras (dvs.en låg protein täckning kunde erhållas), trots att tillräckliga exempel finns, det kan vara nödvändigt att använda en annan proteinas under matsmältningen. I allmänhet ger Trypsin ett tillräckligt antal peptider; dock i vissa fall såsom membranproteiner eller membran domäner av proteiner, antalet tryptic klyvning platser minskas och andra enzymer som inriktning hydrofoba aminosyror är ett bättre val.
När det gäller instrumentering krävs ett särskilt modifierade instrument för infödda masspektrometri som upprätthåller icke-kovalenta interaktioner under överföringen in i gas-fas. Flera typer av mätinstrument har införts, inklusive Q-ToF och orbitrap instrument. Medan modifierade Q-ToF masspektrometrar finns kommersiellt tillgängliga för infödda masspektrometri sedan flera år, den senare endast nyligen introducerade och i de flesta fall kräver specialiserade ändring45. Dock tillämpningen av högupplösta instrument får studera bindningen av flera ligander och deras kvantifiering46,47 och är lovande för kommande ansökningar.
För att identifiera tvärbunden di-peptider av flytande kopplade kromatografi masspektrometri, kan standardförfaranden med några ändringar tillämpas. Databas sökningen är dock den begränsande faktorn som specialiserad programvara kan sällan ta itu med stora databaser och minskad databaser som innehåller protein subunitsna av komplexen krävs. Nyligen genomförda studier används mass spectrometry-cleavable cross-linkers inriktning proteininteraktioner i hela cellen lysates48,49. Användning av kemiska cross-linkers som fragment i tandem mass spectrometry experiment mestadels ger linjär peptider (modifierad av cross-linker), som kan identifieras genom ytterligare fragmentering och databas sökning av linjära peptider, och detta minskar Söktid och computational Sök rum. För att utföra dessa experiment, krävs en massa ion trap-analysator eller en hybrid masspektrometer med en ion trap dock. I allmänhet, eftersom falskt positiva resultat är en viktig fråga, verifieras masspektra av tvärbunden peptider ofta manuellt av kvaliteten på deras fragment spektra som sträcker sig data analys tid enormt. Utveckla robusta scoring system som kan tillämpas utan ytterligare åtgärder för validering är därför potentiella framtida tillämpningar. Ett sätt att förbättra dataanalys och att minska antalet falskt positiva var införandet av falsk upptäckten beräkningar och deras tillämpning på cross-linking datauppsättningar50.
I allmänhet, de tekniker som beskrivs här kan kompletteras med ytterligare masspektrometri tekniker (t.ex., kovalent märkning) att öka produktionen från analysen. Andra ändringar och förbättringar av protokollen kan enkelt implementeras. Som sådan unravels jämförande tvärbindande34 konfirmerande förändringar i sammansättningen protein. Ytterligare utveckling i native masspektrometri tillåter numera analys av membranet proteiner51,52 och deras interaktioner med lipider28,52,53,54 . Ny utveckling av högupplösta masspektrometrar för infödda masspektrometri har utvidgat tillämpningen och ligand bindande, t.ex., bindande av lipider till membranproteiner, kan nu tas med i analys45, 46. i kombination med datormodellering metoder, dessa tekniker kan leverera strukturella modeller av varierande upplösning55. Om ingen kristallstrukturer finns för intakt komplex eller enda subunitsna, kan masspektrometri leverera första insikter proteininteraktioner och okänd komplex topologi. Beroende på de tekniker som används och de resultat som erhållits, kan lågupplösta modeller av okänd komplexet erhållas56,57,58. Om kristallen strukturerar eller homologi modeller finns tillgängliga, kan strukturell information från masspektrometri ge även nära-native modeller59.
I jämförelse med andra strukturella tekniker, masspektrometri har fördelen att det kräver låg prov belopp, det kan hantera heterogena prover och är tillämplig på proteinkomplex av obegränsad storlek. Dessutom kan masspektrometri utredningen av dynamiska protein system. Olika populationer av protein eller proteinkomplex som finns i lösningen analyseras vanligen tillsammans och därför, till skillnad från med andra strukturella tekniker som kräver urval av vissa populationer, alla konformationer bibehålls under analys och är taxeras i ett experiment. Kvantitativa tvärbindande metoder var nyligen införda34,60,61 och är lovande för framtida tillämpningar som beskriver konfirmerande förändringar under olika förhållanden.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar våra kolleger för bra diskussioner. Vi tackar också Ilme Schlichting och Karl-Peter Hopfner för att tillhandahålla proteinkomplex. Vi erkänner finansiering från det federala departement för utbildning och forskning (BMBF, ZIK programme, 03Z22HN22), Europeiska regionala utvecklingsfonden (EFRE, ZS/2016/04/78115) och den MLU Halle-Wittenberg att C.S. och finansiering från Wellcome Trust (109854/658 Z/15/Z) till A.P.
Chemicals, Reagents, Consumables | |||
2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma Aldrich | H4034 | buffer |
Acetic acid | Sigma Aldrich | 695092 | pH |
Acetonitrile Optima LC/MS | Fisher Chemicals | A955-1 | solvent |
Amicon Ultra centrifugal devices (different MWCO) | Millipore | i.e. UFC500396 | buffer exchange, concentration |
Ammonium acetate solution | Sigma Aldrich | A2706 | native MS |
Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 9830 | in-gel digestion |
Ammonium solution | Sigma Aldrich | 9859 | pH |
Bis(Sulfosuccinimidyl)suberate-d0 (BS3-d0) | Thermo Scientific | 21590 | cross-linker |
Bis(Sulfosuccinimidyl)suberate-d4 (BS3-d4) | Thermo Scientific | 21595 | cross-linker |
Caesium iodide | Sigma Aldrich | 203033 | calibration |
Calcium chloride | Sigma Aldrich | C5670 | in-gel digestion |
Capillaries (1.0 OD × 0.78 ID × 100 L mm) | Harvard Apparatus | 30-0038 | native MS |
Disuccinimidyl suberate (DSS) | Thermo Scientific | 21655 | cross-linker |
DL-Dithiothreitol | Sigma Aldrich | D5545 | in-gel digestion |
DMSO (dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | D8418 | solvent |
Ethanol | Fisher Chemicals | BP2818 | solvent |
Formic acid Optima LC/MS | Fisher Chemicals | A117-50 | solvent supplement |
Instant Blue Coomassie staining solution | expedeon | ISB1L | staining solution for gel electrophoresis |
Invitrogen NuPAGE 4-12% Bis-Tris gels (1 mm, 10 well) | life technologies | NP0323BOX | gel electrophoresis |
Iodoacetamide | Sigma Aldrich | I1149 | In-gel digestion |
Isopropyl alcohol, HPLC grade | Fisher Chemicals | P750717 | solvent |
Methanol | Fisher Chemicals | A456-212 | solvent |
Micro BioSpin 6 columns | BioRad | 732-6222 | buffer exchange |
NuPAGE Antioxidant | invitrogen | NP0005 | running buffer, gel electrophoresis |
NuPAGE LDS Sample Buffer (4 ×) | invitrogen | NP0007 | sample loading buffer (non-reducing) for gel electrophoresis |
NuPAGE MES SDS Running buffer | life technologies | NP0001 | gel electrophoresis |
NuPAGE MOPS SDS Running buffer | life technologies | NP0001 | gel electrophoresis |
NuPAGE Sample Reducing Agent (10 ×) | invitrogen | NP0004 | reducing Agent for gel electrophoresis |
PBS – phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P4417 | buffer |
SeeBlue Plus2 Prestained Standard Protein Marker | invitrogen | LC5925 | prestained Protein Marker for gel electrophoresis |
Sodium acetate | Sigma Aldrich | S2889 | ethanol precipitation |
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Sigma Aldrich | 252859 | buffer |
Trypsin | Sigma Aldrich | TRYPSEQ-RO (11418475001) | in-gel digestion |
Vivaspin centrifugal devices (different MWCO) | Sartorius | i.e. VS0101 | buffer exchange, concentration |
Water for HPLC | Sigma Aldrich | 270733-2.5L-M | solvent |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Instruments | |||
Centrifuge Heraeus Fresco 21, bench-top centrifuge | Thermo Scientific | 75002425 | |
Flaming / Brown Micropipette puller Model P-1000 | Sutter Instruments | P-1000 | |
Gelelectrophoresis chamber Xcell SureLock MiniCell | Invitrogen | EI0001 | |
Gold Coater Quorum Q150R S | Quorum Technologies Ltd. | Q150RS | |
Horizontal gel shaker Rotamax 120 T | Heidolph Instruments | 544-41200-00 | |
Q-TOF Ultima mass spectrometer, MS Vision high mass upgrade | Waters (Micromass) | – | |
reversed-phase C18 analytical column Acclaim PepMap (C18, 75 mm I.D., 50 cm, 3 mm pore size) | Thermo Scientific | 164570 | |
reversed-phase C18 pre-column (C18, 150 mm I.D., 2 cm, 5 mm pore size) | Thermo Scientific | 164213 | |
scalpel | Fisher Scientifc | 10463989 | |
SpeedVac SPD121P vacuum centrifuge | Thermo Scientific | SPD121DP-230 | |
Thermomixer C | Eppendorf | 5382000015 | |
Tweezers AA | Sigma Aldrich | Z680184-1EA | |
Ultrasonic cleaner USC-TH, sonication bath | VWR | 142-0084 | |
UltiMate Dionex 3000 nano-LC system, coupled to Q-Exactive plus hybrid mass spectrometer (nano-ESI source) | Thermo Scientific | 0726030+ | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software, Software Tools, Database search | |||
Mascot | www.matrixscience.com | ||
Massign | http://massign.chem.ox.ac.uk | ||
MassLynx | Micromass | ||
MassMatrix | Xu, H. J Proteome Res. 9 (2010) | ||
MaxQuant | Cox, J. Nat. Biotechn. 26 (2008) | ||
pLink | Yang, B. Nat Methods 9 (2012) | ||
pXtract conversion tool | http://pfind.ict.ac.cn/downloads.html | ||
UniDec | Marty, M.T. Anal. Chem. 87 (2015) | ||
XCalibur | Thermo Scientific | ||
XiNET | http://crosslinkviewer.org | ||
XLinkX | Liu, F. Curr Op Struct Biol 35 (2015) | ||
xQuest | Rinner, O. Nat Methods 5 (2008) | ||
Xvis | https://xvis.genzentrum.lmu.de |