이 문서에서는, 우리는 분리 하 고 마우스 긴 뼈에서 골 수 기질 세포와 조 혈 줄기 세포 분화 방법 제시. 두 개의 서로 다른 프로토콜에는 저조한 다른 세포 인구 확장 및 차별화 osteoblasts, adipocytes, osteoclasts에 적합 되 게 됩니다.
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이 논문에서
요약
초록
중간 엽 줄기 세포의 표현으로 일상적으로 사용 되는 세포 인구를 구성 하는 골 수 기질 세포 (BMSCs) 생체 외에서. 그들은 캐비티 내에 골 수 조 혈 줄기 세포 (HSCs), 적혈구, 면역 창시자, 및 osteoclasts 증가 줄 수 있는 함께 상주 합니다. 따라서, 다양 한 세포 인구, 실험 설계 과제를 제시 하 고 데이터 해석을 혼동 수 있는 매우 다른 유형의 혼합에 골 결과에서 세포 인구의 기사. 여러 격리 및 문화 기술 BMSCs 및 HSCs invitro의 더 많거나 적은 균질 인구를 얻기 위하여 실험실에서 개발 되었습니다. 여기, 우리가 마우스 긴 뼈에서 BMSCs 및 HSCs의 격리에 대 한 두 가지 방법을 제시: 부착을 기반으로 BMSCs 및 HSCs의 혼합된 인구를 생성 한 방법 및 두 세포 인구를 분리 하는 한 방법. 두 방법 모두 제공 세포 적합 osteogenic 및 adipogenic 분화 실험 뿐만 아니라 기능적 분석 실험.
서론
기본 murine BMSCs1초기 1980 년대 있는 그들의 발견부터 중간 엽 줄기 세포의 생체 외에서 모델으로 일반적으로 사용 됩니다. 긴 뼈의 골 수 구멍에서 플러시 플라스틱 부착 한 세포의 문화 osteoblasts, osteoclasts, chondrocytes, 또는 많은 연구2,3, adipocytes에 분화 될 수 있는 능력을 유지 하는 사실, 4 , 그러나 5., 골 수는 독특한 조직 HSCs, 내 피, 그리고 면역 세포 포함 하 되이 국한 되지 않음, BMSCs, 하지만 많은 다른 세포 인구의 구성. 따라서, 고립과 문화 기술을 다른 동질성과 세포 인구를 얻을 수 있습니다. 이러한 기술을 사용 하 여 셀에서 잠재적인 차별화 테스트 전하실 수 있습니다. 예를 들어 다른 genotypes와 쥐에서 셀을 비교할 때 데이터의 해석을 제한 혼합된 세포 인구로 시작 합니다. 반대로, BMSCs 및 HSCs의 균질 성 인구 기술적으로 어려울 수 있습니다 고로 대표 되지 않을 수 있습니다 ex vi....
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프로토콜
모든 실험 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 메인 의료 센터 연구소에 의해 승인 되었다.
1. 컬렉션 튜브 준비
- 10% 태아 둔감 한 혈 청 및 1% 페니실린/스의 최소 필수 매체 α (MEM α)을 보완 하 여 BMSC 문화 미디어를 확인 합니다.
- 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 BMSC 문화 미디어의 100 µ L를 배치 합니다. 3 뼈 보통 단일 튜브 그래서 그에 따라 준비 하나에 적합할 것 이다.
- 그들은 원심 분리기 튜브에 들어가도록 충분히 200 µ L 피 펫 팁의 끝을 잘라. 튜브 내부 팁 넣고 뚜껑 얼음에 튜브를 배치 하기 전에 닫을 수 있도록 합니다.
참고: 또는, 0.75 mL microcentrifuge 튜브 끝 잘라 삽입할 수 있습니다 microcentrifuge 1.5 mL 튜브에.
2입니다. 쥐에서 뼈의 수확
- CO2 뒤에 자 궁 경부 전위를 사용 하 여 동물을 안락사 하 고 70% 에탄올으로 그들을 살포.
주: 동물 같은 섹스 그리고 가급적 이면 같은 나이에서 사용 하는 확인 하십시오. 우리는 정기적으로 동물 세 7 ~ 8 주를 사용 합니....
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결과
세포 배양의 개요
두 문화 기술 BMSCs 및 HSCs (총 Bmc, 그림 1A)로 구성 된 Bmc의 혼합된 인구 또는 BMSCs의 인구에 차별화의 평가 HSCs (부착 BMSCs, 그림 1B)에서 분리 수 있습니다. 48 시간 후에 골 수에서 세포 격리 및 도금 (그림 1C), 그들은 신속 하 게 플라스틱 문화 접시의 바닥에 연결 고는 단층을 형성 하는 경향이 있다. 셀 합류 (그림 1D)에 도달, 그들은 감 별 법 분석 실험을 위해 사용할 수 있습니다.
BMSCs Osteoblasts로 분화
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토론
이 문서에서는, BMSCs의 문화의 두 가지 방법은 자신의 장점과 한계 표시 됩니다. 세포는 골 수에서 오는 격리 상대적으로 어려움 없이 과정 이다. 그러나, 중간 엽 줄기 세포 또는 osteoclastic 창시자의 대표적인 세포 인구를 얻기 때문에 골 수 구멍의 다양 한 세포 환경 전하실 수 있습니다.
골 수 내용의 전체를 경작 vivo에서 microenvironment의 가까운 표현을 제공 합니다. 그러나, 생체 외에서 실험의 처음에 BMSCs 또는 HSCs의 아주 다른 수 귀 착될 수 있다 쥐 (genotypes, 트리 트 먼 트, 나가, 등)의 다른 그룹에서 세포를 분리. 따라서, BMSCs 및 HSCs를 분리 하 고 다시 그들을 도금 차별화 실험의 시작에 휴대폰 번호를 통해 더 나은 제어를 허용 합니다. 그러나, 세포 배양의이 감소 수 있습니다 영향을 BMSCs 또는 HSCs의 결과 둘 다 분 엽 및 osteoclastic.......
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공개 사항
저자 들은 관심사의 재정적인 충돌 공개.
감사의 글
이 작품은 건강의 국가 학회 (R01 AR061164-01A1)에 의해 지원 되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 200&뮤; L 피펫 팁 | Rainin | 17014401 | |
| 1.5 mL 원심분리기 튜브 | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 15 mL 원추형 튜브 | VWR | 89039-668 | |
| 50 mL 원뿔형 튜브 | VWR | 89039-660 | |
| 인산염 완충 식염수 (PBS) | Sigma-Aldrich | 21-040-CM | |
| 에탄올 | 피셔 사이언 | 04-355-451 | |
| 해부 도구 | |||
| 70 μ m 필터 | BD Falcon | 352350 | |
| 0.25% 트립신 | Gibco | 25200 | |
| Kimwipe | VWR | 82003-820 | |
| 파라포름알데히드(PFA) | 전자 현미경 과학 | 15710 | |
| 알칼리성 인산가수분해효소 키트 | Sigma-Aldrich | 86R | |
| 질산은 | Sigma-Aldrich | S6506 | |
| 나트륨 티오 설페이 | 시그마 -알드리치 | S7026 | |
| 오일 레드 O | 시그마 -알드리치 | O0625 | |
| 이소프로판올 | 시그마 알드리치 | 190764 | |
| 10 % 중성 완충 포르말린 | 시그마 -알드리치 | F5554-4L | |
| Whatman 필터 등급 1 | 시그마 알드리치 | Z274852 | |
| 주석산 내성 산 인산 가산 분해 효소 키트 | 시그마-알드리치 | 387A | |
| 글루타르알데히드 | 전자 | 16220 | |
| MEM&알파; | Gibco | 12571 | |
| 태아 소 혈청 | VWR | 97068-085 | |
| 페니실린/스트렙토마이신 | 인비트로젠 | 15140-122 | |
| &베타;-글리세롤 포스페이 | 시그마-알드리치 | G9891 | |
| 아스코르브산 | 시그마-알드리치 | A4544 | |
| DMEM 고포도당 | 시그마-알드리치 | D5796 | |
| 로시글리타존 | 케이맨 화학 | 717410 | |
| 인슐린 | 시그마-알드리치 | I6634 | |
| IBMX | 시그마-알드리치 | I5879 | |
| 덱사메타손 | 시그마-알드리치 | D4902 | |
| RANKL | 페프로텍 | 310-01 | |
| mCSF | 페프로텍 | 315-02 | |
| Axio Observer 인버터 현미경 | Zeiss |
참고문헌
- Friedenstein, A. J., Latzinik, N. W., Grosheva, A. G., Gorskaya, U. F. Marrow microenvironment transfer by heterotopic transplantation of freshly isolated and cultured cells in porous sponges. Exp Hematol. 10 (2), 217-227 (1982).
- Chen, T. L.
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재인쇄 및 허가
