इस प्रोटोकॉल में सेल लाइनों और प्राथमिक कोशिकाओं के लिए चिप-seq, 4sU-seq, कुल आरएनए-seq, और ribosome profile के मिश्रित उपयोग का वर्णन है । यह समय के साथ प्रतिलेखन फ़ैक्टर बाइंडिंग, de नोवो प्रतिलेखन, आरएनए प्रोसेसिंग, कारोबार और अनुवाद में परिवर्तन पर नज़र रखने में सक्षम बनाता है, और सक्रिय और/या तेजी से बदलती कोशिकाओं में घटनाओं के समग्र पाठ्यक्रम प्रदर्शित
सक्रियण पर, कोशिकाओं को तेजी से अपने कार्यात्मक कार्यक्रमों को बदलने और, जिससे, उनके जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल । जीन अभिव्यक्ति में बड़े पैमाने पर परिवर्तन, उदाहरण के लिए, सेलुलर भेदभाव, morphogenesis के दौरान, और कार्यात्मक उत्तेजना (जैसे प्रतिरक्षा कोशिकाओं के सक्रियकरण के रूप में), या दवाओं और स्थानीय वातावरण से अंय कारकों के लिए जोखिम के बाद हो । उत्तेजना और कोशिका के प्रकार पर निर्भर करता है, इन परिवर्तनों को तेजी से होते है और जीन विनियमन के किसी भी संभव स्तर पर । उत्तेजना के एक निश्चित प्रकार के लिए एक प्रतिक्रिया सेल के सभी आणविक प्रक्रियाओं को प्रदर्शित/आणविक जीवविज्ञान में सबसे कठिन कार्यों में से एक है । यहां, हम एक प्रोटोकॉल है कि जीन विनियमन के कई परतों के एक साथ विश्लेषण सक्षम बनाता है का वर्णन । हम विशेष रूप से तुलना, प्रतिलेखन कारक बाध्यकारी (क्रोमेटिन-immunoprecipitation-अनुक्रमण (चिप-seq)), de नोवो प्रतिलेखन (4-thiouridine-अनुक्रमण (4sU-seq)), mRNA प्रसंस्करण, और कारोबार के रूप में अच्छी तरह के रूप में अनुवाद (ribosome profile). इन तरीकों के संयोजन से, यह कार्रवाई की एक विस्तृत और जीनोम व्यापक पाठ्यक्रम प्रदर्शित करने के लिए संभव है ।
अनुक्रमण नव लिखित आरएनए विशेष रूप से सिफारिश की है जब तेजी से अनुकूलन या सिस्टम को बदलने, विश्लेषण के बाद से यह 4sU जोखिम के समय के दौरान सभी जीन की transcriptional गतिविधि को दर्शाया गया है (चाहे वे कर रहे है या downregulated) । कुल आरएनए-seq और ribosome profile के मिश्रित उपयोग आरएनए कारोबार और अनुवाद दरों की गणना की अनुमति देता है । उच्च प्रवाह अनुक्रमण परिणाम के Bioinformatic विश्लेषण के विश्लेषण और डेटा की व्याख्या के लिए कई साधन के लिए अनुमति देता है । उत्पंन डेटा भी ट्रैकिंग सह transcriptional और वैकल्पिक ब्याह, बस कुछ संभावित परिणामों का उल्लेख करने के लिए सक्षम बनाता है ।
संयुक्त दृष्टिकोण यहां वर्णित विभिंन मॉडल जीवों या कक्ष प्रकार, प्राथमिक कोशिकाओं सहित के लिए लागू किया जा सकता है । इसके अलावा, हम प्रत्येक विधि के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, गुणवत्ता नियंत्रण सहित, और संभावित समस्याओं और नुकसान पर चर्चा ।
हाल के वर्षों में, आरएनए-अनुक्रमण (आरएनए-seq) एक कोशिका या एक जीव1के भीतर सभी व्यक्त RNAs का विश्लेषण करने के लिए मानक उपकरण बन गया है । हालांकि, एक विशिष्ट उत्तेजना के जवाब में अनुकूल कोशिकाओं की पूरी प्रक्रिया को समझने के लिए/दवा, यह पूरी तरह से सभी अंतर्निहित प्रक्रियाओं, प्रसंस्करण, कारोबार, और अनुवाद करने के लिए mRNA प्रतिलेखन से लेकर निर्धारित करने के लिए आवश्यक है । आरएनए प्रतिलेखन में अल्पकालिक परिवर्तन शायद ही कुल RNAseq द्वारा मापा जा सकता है, के बाद से कुल आरएनए के परिवर्तन कारकों पर निर्भर करते हैं जैसे आरएनए आधा जीवन और transcriptional गतिविधि, जो कोशिकाओं के अनुकूलन को प्रतिबिंबित करने के लिए एक गरीब टेम्पलेट हैं पर्यावरणीय प्रभाव2,3. वास्तव में, नए अनुक्रमण तकनीक की एक किस्म विकसित किया गया है कि जीन विनियमन4 की प्रक्रिया में जब सही तरीके से संयुक्त में विभिंन चरणों का एक विश्लेषण की अनुमति । इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे कुछ नहीं बल्कि आसानी से लागू अनुक्रमण तकनीक है कि एक तुलनात्मक तरीके से mRNA की आवश्यक परतों के विनियमन पर नज़र रखने की अनुमति गठबंधन के लिए । transcriptional गतिविधि का विश्लेषण करने के लिए, तरीकों की एक किस्म का वर्णन किया गया है, जैसे कि टोपी विश्लेषण के रूप में जीन अभिव्यक्ति (पिंजरे)5, देशी बढ़ाव प्रतिलिपि अनुक्रमण (NET-seq)6, और जीनोम-वाइड परमाणु रन पर (मूह-seq)7 , 8, साथ ही bromouridine अनुक्रमण (बरू-seq) और 4-thiouridine-अनुक्रमण (4sU-seq), जो चयापचयों कि नव लिखित आरएनए9में शामिल कर रहे हैं का उपयोग करें,10, बस कुछ उल्लेख करने के लिए. जबकि पिंजरे सटीक प्रतिलेखन शुरू साइट की पहचान करता है, नेट-seq और मूह-seq दिशाओं पढ़ने के बारे में अधिक सटीक जानकारी देने, और 4sU-seq (जो विधि यहां वर्णित है) केवल नए लिखित आरएनए का पता लगाता है । हालांकि, 4sU-seq अत्यधिक संवेदनशील है और सक्रिय रूप से बदलती कोशिकाओं में मात्रात्मक transcriptional गतिविधि को मापने के लिए, साथ ही mRNA प्रोसेसिंग में मात्रात्मक परिवर्तन (जो मिनटों में होता है)9, के लिए विभिंन समय फ़्रेम में लागू किया जा सकता है, 11,12. इसके अलावा, 4sU-seq आरएनए के साथ गठबंधन करने के लिए आदर्श है-seq के लिए आरएनए कारोबार दरों की गणना करने के लिए9. mRNA की प्रतिलेखनी आरएनए पोलीमरेज़ द्वितीय (RNAPII) द्वारा किया जाता है, जो इस तरह के प्रतिलेखन कारकों, हिस्टोन संशोधनों के रूप में कारकों की एक भीड़ से प्रभावित बारी में है, और सामान्य उत्प्रेरक/दमन कि भी transcriptional का हिस्सा हो सकता है परिसर. कितने जीन/प्रमोटर/बढ़ाने क्षेत्रों का परीक्षण करने के लिए एक कारक से बंधे हैं, चिप-seq विकसित किया गया है, जो अब इस प्रयोजन के लिए मानक विधि है, कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटीबॉडी13के कारण । हालांकि, हालांकि ChIPseq जहां विनियमन कारकों को बांध पर स्पष्ट जानकारी देता है, यह प्रतिबिंबित अगर यह वास्तव में प्रतिलेखन में परिवर्तन की ओर जाता नहीं है14। इसलिए, 4sU-seq के साथ चिप seq प्रदर्शन ऐसे जैविक प्रश्नों के लिए आदर्श संयोजन है । जीन अभिव्यक्ति का विनियमन भी बाद के चरण में हो सकता है, क्योंकि mRNA और प्रोटीन के स्तर को जरूरी15,16सहसंबंधी नहीं बनाना, शोधों या पद-शोधों पर संभावित महत्वपूर्ण नियमन का संकेत स्तर, संदर्भ के आधार पर । वर्ष 2011 में, ribosome रूपरेखा पहले आरएनए-seq के साथ संयुक्त किया गया था और अब परिवर्तन है कि तेजी से प्रोटीन में होते हैं, के बाद से वहाँ अभी भी जन स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ कुछ संवेदनशीलता सीमा कर रहे हैं करने के लिए पसंद की विधि है17. वास्तव में, अनुवाद इस तरह के तरीकों से प्राप्त दरों को प्रोटीन के स्तर में परिवर्तन का एक अपेक्षाकृत अच्छा अनुमान देने दिखाया गया है (कम से अधिक लंबी अवधि के परिवर्तन के लिए मापा) और अनुवाद की प्रक्रिया पर एक भी अधिक विस्तृत देखने की अनुमति, उदा स्टार्ट-साइड और वैकल्पिक अनुवाद का निर्धारण17फ्रेम । सभी चार विधियों का मिश्रित उपयोग स्थिर अवस्था में, विभिंन सेल प्रकारों के बीच, या एक समय में तेजी से बदलते सेल11के धारावाहिक प्रयोग में इस्तेमाल किया जा सकता है । यह उपयोग आरएनए प्रतिलेखन, प्रसंस्करण, और अनुवाद को प्रभावित करने वाले प्रतिलेखन कारक में परिवर्तन का एक जीनोम चौड़ा सिंहावलोकन प्रदान करता है ।
जीन विनियमन की पूरी प्रक्रिया का विश्लेषण पूरी तरह से एक विशिष्ट उत्तेजना या उपचार के जवाब में सेलुलर रूपांतरों को समझने के लिए आवश्यक है । कुल आरएनए का मेल-seq, 4sU-seq, ribosome profile, और चिप-seq अलग समय बिंदुओं पर समय के साथ जीन विनियमन की मुख्य प्रक्रियाओं की एक व्यापक विश्लेषण की ओर जाता है । जैविक प्रक्रियाओं की एक गहन समझ के साथ ही प्रयोगात्मक सेटअप परिभाषित करने के लिए आवश्यक है इष्टतम समय अंक ।
के बाद से तरीके जीन विनियमन का अध्ययन तेजी से सुधार, इन प्रोटोकॉल तेजी से परिवर्तन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । इसके बावजूद, वे सेल के किसी भी प्रकार में बुनियादी जीन विनियामक तंत्र का अध्ययन करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण तरीके प्रदान करते हैं । यहां, हम नुकसान और तथ्यों के कुछ एक पर विचार के लिए जब इन तरीकों का उपयोग कर रहा है पर चर्चा की ।
कक्ष: कोशिकाओं को अत्यधिक व्यवहार्य होना चाहिए और, यदि प्राथमिक पृथक कोशिकाओं का उपयोग, कोशिका आबादी की पवित्रता की गारंटी होनी चाहिए (उदा, प्राथमिक टी कोशिकाओं के लिए FACS विश्लेषण) । यहां तक कि थोड़ा बल दिया कोशिकाओं को इन बहुत ही संवेदनशील अनुक्रमण तरीकों के परिणाम को प्रभावित और नव लिखित या अनुवादित आरएनए की मात्रा कम है, और अनुक्रमण परिणामों में तनाव प्रतिक्रिया के अवांछित readouts के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । केंद्रापसारक गति इस प्रोटोकॉल में उल्लेख किया गोली कोशिकाओं को प्राथमिक टी कोशिकाओं के लिए अनुकूलित है । इस प्रकार, गति सेल प्रकार के अनुसार समायोजित करें ।
4 कोशिका शरीर क्रिया विज्ञान पर सु प्रभाव: 4sU अलावा पर सेलुलर फिजियोलॉजी के लिए ंयूनतम गड़बड़ी सत्यापित करने के लिए aforementioned विकल्पों के अलावा, और/या अतिरिक्त विश्लेषण किया जा सकता है, खासकर जब सेल संख्या सीमित हैं । सेल प्रसार पर प्रभाव बस लेबल और unलेबल्ड कोशिकाओं गिनती द्वारा कोशिकाओं के दोहरीकरण समय की पुष्टि के द्वारा परीक्षण किया जा सकता है । Nucleolar तनाव प्रेरण भी nucleolin और नाभिक के इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला के माध्यम से सेल आकृति विज्ञान का विश्लेषण द्वारा परीक्षण किया जा सकता है । आगे 4sU के प्रभाव को सत्यापित करने के लिए, बदल वैश्विक जीन अभिव्यक्ति द्वारा मापा जा सकता है correlating पढ़ें कुल आरएनए लेबल से कुल आरएनए की गिनती ।
कक्ष क्रमांक: के लिए इन विट्रो जनरेट किया गया T कक्ष, हम अनुशंसा करते है कम से तालिका 2में इंगित कक्षों की मात्रा के साथ प्रारंभ कर रहा है । कक्षों के प्रकार के अनुसार प्रति विधि पर्याप्त संख्याएं चुनें । के बाद से टी कोशिकाओं को कम कोशिका द्रव्य और आरएनए अन्य कोशिकाओं की तुलना में, अन्य कोशिकाओं की सबसे अधिक संभावना कम मात्रा पर्याप्त हो जाएगा. चिप-seq के लिए, सेल नंबर अत्यधिक इस्तेमाल किया एंटीबॉडी पर निर्भर करता है और कोशिकाओं के भीतर ब्याज की अभिव्यक्ति के स्तर के प्रोटीन । हिस्टोन या RNAPII चिप के लिए, fewe कोशिकाओं, इस्तेमाल किया जा सकता है, जबकि सेल संख्या में वृद्धि की जरूरत है जब प्रतिलेखन कारकों का उपयोग किया जाता है, खासकर यदि वे निंन स्तर पर व्यक्त कर रहे हैं ।
4 र-लेबलिंग और आरएनए biotinylation: अनुयाई कोशिकाओं का उपयोग करते समय, 4sU लेबलिंग Rädle एट अलद्वारा वर्णित के रूप में निर्देशित किया जा सकता है । 19 के बाद से कोशिकाओं को बहुत तेजी से 4sU शामिल, यह निलंबन, अनुयाई, या अर्द्ध अनुयाई कोशिकाओं के माध्यम से सीधे जोड़ा जा सकता है ।
यह biotinylation के 60-80 µ जी आरएनए के साथ शुरू करने के लिए सिफारिश की है । फिर भी, आरएनए के कम मात्रा में इस्तेमाल किया जा सकता है, हालांकि हम 30 से कम µ जी के लिए परीक्षण नहीं किया है एक coprecipitant जोड़ें (उदा., GlycoBlue) जब आरएनए तेज अगर गोली देखना मुश्किल है । गूंथा हुआ एट अल. यह भी दिखाया गया है कि methylthiosulfonate-सक्रिय बायोटिन (MTS-बायोटिन) अधिक कुशलता से HPDP-बायोटिन31की तुलना में 4sU-लेबल आरएनए के साथ प्रतिक्रिया करता है । इसलिए, यह टन के लिए स्विचन-बायोटिन, विशेष रूप से, छोटे RNAs है, जो कम uridine अवशेषों के लिए करते है की वसूली के लिए पर विचार करने लायक हो सकता है (गूंथा हुआ आटा एट अल द्वारा उल्लेख biotinylation प्रोटोकॉल को देखें .; 4sU का शुद्धिकरण देखें-त्यसपछि आरएनए, प्रायोगिक प्रक्रियाएं) ।
नव लिखित आरएनए की वसूली के लिए, यह अपनी पसंद के paramagnetic मोती या आरएनए सफाई मोतियों का उपयोग करने के लिए संभव है । हमेशा ध्यान में रखना है कि इन किट या विशिष्ट RNAs के लिए शुद्ध नहीं हो सकता है । उदाहरण के लिए, यदि आप miRNAs में रुचि रखते हैं, miRNA कैप्चर और sequencing के लिए विशिष्ट किट का उपयोग करने पर विचार करें ।
नव लिखित आरएनए के ठहराव: सही रूप में नव लिखित आरएनए को मापने के लिए, माप एक उपयुक्त fluorometer ( सामग्री की तालिकादेखें) द्वारा किया जाना चाहिए । 4sU एक्सपोजर के 1 एच के भीतर, नव लिखित आरएनए कुल आरएनए के लगभग 1-4% का प्रतिनिधित्व करता है । 1 एच लेबल की नव लिखित आरएनए, सक्रिय टी कोशिकाओं के होते हैं ~ 90-rRNA के 94%11.
Ribosome profile: जब विधि की स्थापना, हम निर्धारित किया है कि 1.5 x का उपयोग कर nuclease की राशि से मूल प्रोटोकॉल में सुझाव दिया उचित पाचन की गारंटी देता है । इसके अलावा, nuclease की उन्नत मात्रा के लिए कोई प्रतिकूल प्रभाव रिपोर्ट किया गया है । चूंकि यह RPFs को पचाने में काफी मुश्किल है, जबकि वे राइबोसोमल प्रोटीन से बंधे आरएनए का हिस्सा हैं, आप अभी भी थोड़ा अनुमापन इष्टतम nuclease पाचन के लिए राशि में वृद्धि कर सकते हैं ।
RPF आरएनए के 500 से कम एनजी चरण 4.4.2 में बरामद किया गया था, rRNA कमी और आरएनए स्वच्छ और ध्यान देने वाला-5 कॉलम के साथ शुद्ध RPFs पूल दोहराएँ. वैकल्पिक रूप से, जेल (step 4.5.3) पर एक दूसरे के बगल में दो समान नमूने लोड करें और जेल (step 4.5.6) से आरएनए रेफरेंस के दौरान पूल जेल स्लाइस करें ।
हम 28 और 30 nt बैंड के लिए संभव के रूप में कसकर एक जेल पर RPFs काटने की सिफारिश । यह rRNAs और tRNAs से अवांछित अंशों को नष्ट करने में मदद करता है, जो बाद में आपकी लाइब्रेरी का हिस्सा बन जाएगा और आपके RPFs के लिए अनुक्रमण पढ़ता कम करेगा ।
यह भी जेल शुद्धि के दौरान यूवी प्रकाश से बचने के लिए सिफारिश की है । यह आरएनए टुकड़े में निक बना सकते हैं, साथ ही न्यूक्लियोटाइड dimers, कि अंत में गंभीर रूप से पुस्तकालय की तैयारी और अनुक्रमण परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं.
लाइब्रेरी तैयार करना और डेटा का अनुक्रमण करना: Ribosome profiling प्रोटोकॉल sequencing के लिए उपयुक्त एक सीडीएनए लायब्रेरी जनरेट करने के लिए सक्षम करता है । 4sU-लेबलिंग द्वारा उत्पंन नमूनों सीधे किसी भी उपयुक्त आरएनए अनुक्रमण किट के साथ पुस्तकालय तैयारी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । चूंकि नव लिखित आरएनए, खासकर जब लघु लेबलिंग बार का उपयोग कर, अभी तक polyadenylated नहीं हो सकता है, नहीं पाली-एक चयन किया जाना चाहिए । इसके बजाय, हम दृढ़ता से वास्तविक नमूने के लिए अनुक्रमण गहराई को कम करने को रोकने के लिए rRNA कमी की सिफारिश । टी कोशिकाओं का उपयोग करना, हम 400 नव लिखित और कुल आरएनए के एनजी के साथ शुरू किया (किट पर निर्भर करता है, सामग्री को देखने), पीसीआर प्रवर्धन के लिए rRNA कमी और कम चक्र के लिए प्रदर्शन किया । पुस्तकालय की तैयारी कम प्रारंभिक सामग्री के साथ किया जा सकता है । पीसीआर साइकिल की जटिलता नंबर पुस्तकालय के लिए खाते के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए ।
चिप के लिए seq वहां भी कई किट पुस्तकालय की तैयारी के लिए उपलब्ध हैं । हमारे हाथ पुस्तकालय की तैयारी में अच्छी तरह से काम किया 2 चिप डीएनए के एनजी के साथ शुरू (जो किट का उपयोग करने के लिए एक सुझाव के लिए सामग्री देखें) । अनुक्रमण के दौरान रंग संतुलन के लिए सूचकांक की जांच करने के लिए सुनिश्चित करें । हम अनुशंसा करते हैं एक sequencing गहराई ≥ 40 x 106 के लिए प्रत्येक पढ़ता है 4sU-seq, कुल आरएनए-seq, और चिप-seq नमूने, और ≥ 80 x 106 पढ़ता है ribosome नमूने के लिए । अनुक्रमण गहराई नमूना और बहाव bioinformatics विश्लेषण पर निर्भर करता है और ध्यान से विचार किया जाना चाहिए । का विश्लेषण करने के लिए intronic cotranscriptional ब्याह के लिए पढ़ता है, 100 बीपी युग्मित-अंत अनुक्रमण चुना जाना चाहिए ।
sequencing बायस: अनुक्रमण सोने के मानक बन गया है जब प्रतिलेखन, अनुवाद, या प्रतिलेखन कारक बंधन में वैश्विक परिवर्तन का निर्धारण । हाल के वर्षों के भीतर, मौजूदा तरीकों उनकी सीमा को धक्का दिया या नई तकनीक आरएनए के तेजी से छोटे शुरू मात्रा अनुक्रमण के लिए विकसित किए गए थे । यह सीडीएनए के प्रवर्धन की आवश्यकता है, जो शोर या पूर्वाग्रह का परिचय । हाल ही में, अनंय आणविक पहचानकर्ता (UMIs) को पीसीआर द्वारा पेश किए गए डुप्लिकेट की पहचान करने के लिए विकसित किया गया था । हाल ही में, यह है कि UMIs बस हल्का अनुक्रमण शक्ति और अंतर जीन अभिव्यक्ति32के लिए झूठी खोज दर में सुधार दिखाया गया था । फिर भी, सभी अनुक्रमण पुस्तकालयों के लिए पुस्तकालय जटिलता के लिए नियंत्रित करने के लिए अद्वितीय आणविक पहचानकर्ता (UMIs) का उपयोग करने पर विचार, खासकर जब आरएनए की कम मात्रा के साथ शुरू करने और कई पीसीआर चक्र की जरूरत है जब.
बफ़र और स्टॉक समाधान: 4sU-seq और ribosome profiling के लिए सभी बफ़र्स nuclease-मुक्त पानी का उपयोग कर सख्त RNase मुक्त शर्तों के तहत तैयार किया जाना चाहिए । यह पूर्व बनाया nuclease-मुक्त NaCl, Tris-एचसीएल, EDTA, सोडियम साइट्रेट, और पानी खरीदने के लिए सिफारिश की है । nuclease-मुक्त शर्तों को सुनिश्चित करने के लिए, एक RNase दूषित समाधान पिपेट या सतहों को साफ करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । चिप-seq के लिए सभी बफ़र्स कम से DNase मुक्त होना चाहिए और कमरे के तापमान पर संग्रहित किया जा सकता है । हमेशा का उपयोग करने से पहले, फॉस्फेट अवरोधकों जोड़ने और बर्फ पर रखने के लिए ।
Bioinformatics: सभी अनुक्रमण डेटा का विश्लेषण (यानी, चिप-seq, आरएनए-seq, और ribsosome profiling) गुणवत्ता नियंत्रण शामिल है (उदा., FastQC, http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/का उपयोग करना), अनुकूलक ट्रिमिंग (जैसे, साथ cutadapt20) अध्ययन के तहत कोशिकाओं के लिए संदर्भ जीनोम को मानचित्रण द्वारा पीछा किया । आरएनए-seq डेटा के लिए (कुल और 4sU-seq दोनों), साथ ही साथ ribosome डेटा की रूपरेखा, एक ब्याह आरएनए-seq मैपर आवश्यक है, जैसे ContextMap 221। चिप-seq डेटा के लिए, BWA का उपयोग करते हुए-मेम22 पर्याप्त है । जीन अभिव्यक्ति RPKM मॉडल का उपयोग कर गणना की जा सकती है (प्रति दस लाख टुकड़े मैप प्रति एक्सॉन के Kilobase)1, का निर्धारण करने के बाद एक कार्यक्रम का उपयोग कर जीन प्रति पढ़ें गिनती, featureCounts23 उदा । पीक चिप से बुला-seq डेटा के लिए, प्रोग्राम के एक नंबर उपलब्ध हैं, उदा, एमएसीएस24 या मणि25। इसके अलावा बहाव का विश्लेषण आर26में किया जा सकता है, विशेष रूप से द्वारा प्रदान की उपकरण का उपयोग कर27।
यहां, 4sU-और कुल आरएनए स्तर और ribosome profiling से शोधों की गतिविधि को एकीकृत करने में एक बड़ी चुनौती सामांयीकरण है । इस समस्या को हल करने के लिए एक शास्त्रीय दृष्टिकोण के लिए घर के स्तर को सामान्य रखने के जीन है. व्यक्तिगत घर के लिए यादृच्छिक उतार चढ़ाव के कारण शोर को कम रखने के जीन, यह सिर्फ कुछ घर का उपयोग नहीं करने की सिफारिश की है, लेकिन एक बड़ा सेट के लिए औसत स्तर रखने जीन, > 3, 000 घर-ट्विटर और Levanon 28 द्वारा संकलित जीन रखने उदा . 4sU के अनुपात से आरएनए कारोबार दर की गणना के लिए-कुल आरएनए के लिए, सामान्यता औसत कारोबार दरों पर आधारित है (जैसे, एक आरएनए 5h के आधा जीवन संभालने)29. हालांकि, के बाद से यह घर रखने के जीन के लिए कोई समग्र परिवर्तन, हम अनुशंसा करते है सामांय से स्वतंत्र विश्लेषण दृष्टिकोण का उपयोग कर, उदा, सहसंबंध-आधारित clustering एक समय के विभिंन प्रकार के डेटा के समूहों की पहचान करने के लिए जीन सक्रियकरण के दौरान प्रतिलेखन और अनुवाद में विशिष्ट व्यवहार के साथ । विभिंन डेटा प्रकारों के bioinformatical एकीकरण पर विस्तृत वर्णन के लिए, हम मूल प्रकाशन11को संदर्भित करते हैं ।
टर्नओवर दरों और डेटा एकीकरण का विश्लेषण: हाल ही में प्रकाशित एक पेपर33 की तुलना में एक मल्टीप्लेक्सेड जीन नियंत्रण (MGC) द्वारा वैश्विक तरीकों के लिए निर्धारित आधा जीवन दिखा सकता है कि आधे जीवन अंय तरीकों की तुलना में चयापचय लेबलिंग विधियों द्वारा प्राप्त उन लोगों के साथ सबसे अच्छा संबंधित (उदा, दवाओं द्वारा प्रतिलेखन के सामांय निषेध) । हालांकि, यह उल्लेख किया जाना चाहिए कि आधा जीवन गणना के बीच मतभेद पैदा कर सकते है और 15,34वर्णित किया गया है । हम समस्याओं और मतभेद है कि तनाव की प्रतिक्रिया से लंबे समय तक 4sU जोखिम के कारण पेश कर रहे है के अधिकांश के लिए खाते । इसलिए, यह 4sU-लेबलिंग द्वारा शुरू की तनाव प्रतिक्रिया को बाहर करने के लिए अपरिहार्य है । आगे कारोबार दरों को मांय करने के लिए, हम MGCs के उपयोग की सलाह देते हैं ।
इसके अतिरिक्त, एक डेटा सेट के रूप में यहां भी एक अधिक एकीकृत डेटा विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकताहै (उदा, लंबे समय गैर कोडिंग RNAs के विनियमन)35,36।
The authors have nothing to disclose.
हम लार्स Dölken सलाह के लिए प्राथमिक टी कोशिकाओं के लिए 4sU लेबलिंग स्थापित करने के लिए धन्यवाद; Elisabeth ग्रेफ और थॉमस Schwarzmayr पुस्तकालय पीढ़ियों और अनुक्रमण में महत्वपूर्ण मदद के लिए; RNAPII और टी सेल एंटीबॉडी प्रदान करने के लिए कटार Eick और एंड्रयू Flatley; N. Henriette Uhlenhaut और Franziska Greulich चिप-seq के लिए पुस्तकालय तैयार करने में मदद के लिए; wedding C. Friedel को ड्यूश Forschungsgemeinschaft (DFG) से अनुदान FR2938/7-1 और सीआरसी ११२३ (Z2) द्वारा समर्थित किया गया; एलके Glasmacher ने ग्रांट जीएलई 870/1-1 से ड्यूश Forschungsgemeinschaft (DFG) और जर्मन सेंटर फॉर डायबिटीज रिसर्च (DZD), Helmholtz ज़ेंत्रम München का समर्थन किया था ।
4sU-labeling | |||
4-thiouridine (100 mg) | Carbosynth | 13957-31-8 | Prepare 50 mM stock in sterile H2O/PBS; store at –20°C in aliquots of 50-500 µl; do not refreeze. |
1.5 ml safe-lock tubes | Eppendorf | 30121589 | Optional |
1.5 ml screw-top polypropylene tubes | Sarstedt | 72692005 | Compatible with Dimethylformamide |
15 ml tubes | BD Falcon | 352096 | Compatible with Dimethylformamide |
2.0 ml screw-top polypropylene tubes | Sarstedt | 72694005 | Compatible with Dimethylformamide |
50 ml tubes | BD Falcon | 352070 | Compatible with Dimethylformamide |
Agencourt RNAClean XP | Beckman Coulter | A63987 | We recommend to use these paramagnetic beads. Aliquot and store at 4°C |
Chloroform | Sigma Aldirch | 372978 | WARNING – HAZARDOUS TO HEALTH |
Dimethylformamide | Sigma Aldrich | D4551 | |
Dithiothreitol (DTT) | Roth | 6908.1 | Prepare as 100 mM DTT in nuclease-free H2O; always prepare fresh |
Ethanol | Merck | 1.00983.1000 | |
EZ-Link Biotin-HPDP (50 mg) | Pierce | 21341 | Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving 50 mg Biotin-HPDP in 50 ml DMF. Gentle warming enhances solubilisation. Store at 4°C in aliquots of 1 ml. DMF dissolves some plastic materials. We recommend to use glass pipettes to transfer DMF from ist stock glass bottle to 50 ml Falcon tubes. |
High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
Isopropanol | Merck | 1.09634.1011 | |
NaCl (5M) | Sigma Aldrich | 71386 | Stock solution |
nuclease-free EDTA (500 mM ), pH 8.0 | Invitrogen | 15575-020 | Stock solution |
Nuclease-free H2O | Sigma Aldrich | W4502 | Stock solution |
nuclease-free Tris Cl (1M), pH 7.4 | Lonza | 51237 | Stock solution |
Phase Lock Gel Heavy tubes (2.0 ml) | 5Prime | 2302830 | Use in step 1.3.4. |
Polypropylene 15 ml centrifuge tubes | Greiner Bio-One | 188271 | Or equivalent; they have to tolerate up to 15,000 × g |
QIAzol Lysis Reagent (200 ml) | Qiagen | 79306 | Use this or equivalent TRI reagent for RNA isolation, WARNING – CORROSIVE and HAZARDOUS TO HEALTH! Ensure immediate access to Phenol antidote (PEG-Methanol) |
Qubit RNA HS assay kit | Life Technologies | Q32852 | Use this kit for quantifying RNA quantity in step 1.4.11 |
RNeasy MinElute Kit | Qiagen | 74204 | Optional; includes Buffer RLT |
Sodium citrat | Sigma Aldrich | C8532 | Prepare 1.6 M stock solution using nuclease-free water |
Tween 20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
µMacs Streptavidin Kit | Miltenyi | 130-074-101 | Store at 4°C, includes µMacs columns used in step 1.4.6. (store at RT) |
Cell viability and stress assay | |||
PE Annexin V Apoptosis Detection Kit I | BD Biosciences | 559763 | Optional |
Thapsigargin | Sigma-Aldrich | T9033 | Optional |
p53 | abcam | ab26 | Optional |
p-EIF2a (Ser51) | Cell Signaling | 9721 | Optional |
BH3I-1 | Sigma-Aldrich | B 8809 | Optional |
Buffers | |||
4sU Washing Buffer | store at RT | 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.1% Tween 20 in nuclease-free H2O | |
Biotinylation Buffer (10x) | store at 4 °C | 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA in nuclease-free water; make aliquots of 1 ml; store at 4°C | |
RNA precipitation buffer | store at RT | 1.2 M NaCl, 0.8 M sodium citrate in nuclease free water. Prepare in advance under nuclease-free conditions. Store at room temperature in 50 ml falcon tubes. | |
Equipment | |||
2100 Bioanalyzer instrument | Agilent | G2939BA | |
RNA 6000 Nano Kit | Agilent | 5067-1511 | Use this kit to verify RNA integrity in step 1.3.10 |
RNA 6000 Pico Kit | Agilent | 5067-1513 | Optional |
UV/VIS spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 1000 | Or equivalent. Use in step 1.2.2/3.1.8/3.3.3/3.4.3 |
High-speed centrifuge | Thermo Scientific | Heraeus Multifuge X3R | Or equivalent equipment capable of reaching 13,000 × g |
High-speed rotor | Thermo Scientific | Fiberlite F15-6 x 100y | |
Adaptors for 15 ml tubes | |||
Refrigerated table-top centrifuge | Eppendorf | 5430 R | Or equivalent. |
Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer C | Or equivalent. |
Magnetic stand | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | One stand holds 8 µMacs columns. |
Ultra-fine scale | Mettler Toledo | ML204T | Or equivalent. |
E-Gel iBase Power System | Invitrogen | G6400UK | For RNA gels; or equivalent. |
E-Gel EX 1% agarose precast gels | Invitrogen | G4020-01 | For RNA gels; or equivalent. |
DynaMag-2 Magnet-1 each | Life Technologies | 12321D | |
RNaseZap | Sigma | R2020 | Optional |
TruSeq stranded total RNA library prep kit | Illumina | RS-122-2201 | Or equivalent. For T cells we used 400 ng 4sU and Total RNA with 11 cycles for PCR amplification. rRNA depletion is included in this kit |
Nanodrop | Thermo Scientific | use a Nanodrop or equivalent instrument to measure RNA concentration | |
Ribosome Profiling | |||
TruSeq Ribo Profile kit (Mammalian or Yeast) | Illumina | RPYSC12116 (Yeast) | |
TruSeq Ribo Profile kit (Mammalian or Yeast) | Illumina | RPHMR12126 (Mammalian) | |
Illustra MicroSpin S-400 HR Columns | GE Healthcare | 27-5140-01 | |
RNA Clean & Concentrator-25 kit | Zymo Research | R1017 | |
RNA Clean & Concentrator-5 kit | Zymo Research | R1015 | |
Ribo-Zero Gold rRNA Removal Kit (Human/Mouse/Rat) | Illumina | MRZG126 or MRZG12324 | |
(High Sensitivity DNA Kit) | Agilent Technologies | 5067-4626 | Already needed for 4sU-seq |
All other consumables and equipment are listed in the User guide | !!! | Carefully read the user guide and order required consumables in advance (consider a long delivery time for some consumables e.g. gels) | |
ChIP | |||
10 mM Tris-HCl (pH 8.0) | gereral lab supplier | ||
100 bp Plus Marker | Thermo Fisher | SM0323 | |
16 % Formaldehyde | Thermo Fisher | 28908 | Add to a final concentration of 1 % |
70% EtOH | gereral lab supplier | Always prepare fresh | |
Agarose | gereral lab supplier | ||
Agencourt RNAClean XP beads | Beckman Coulter | A63987 | We recommend to use these paramagnetic beads. Aliquot and store at 4°C |
ChIP library preparation kit | KapaBiosystems | KK8504 | Or use the kit of your choice |
DNA low bind microcentrifuge tubes | Eppendorf | Z666548-250EA | or equivalent |
Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10004D | Use these superparamagnetic beads coupled to protein G in step 4.3.1.; Bring to RT before use |
Glycine | gereral lab supplier | Prepare a 2M stock solution | |
Glycogen | Roche | 10-901-393-001 | |
MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | Use this kit (or equivalent) to purify chromatin in step 4.2.4. |
Phosphatase Inhibitor (PhosStop) | Roche | 4906837001 | Add freshly to the buffer and keep on ice |
Power SYBRgreen Master mix | Thermo Fisher | 4367659 | |
Protease Inhibitor (cOmplete, EDTA-free) | Roche | 11873580001 | Add freshly to the buffer and keep on ice |
Proteinase K | Invitrogen | 25530049 | |
Qubit dsDNA HS Assay kit | Invitrogen | Q32851 | Use this kit for quantifying DNA quantity in step 4.6.4. on a Qubit Fluorometer |
Rnase, DNase free | Roche | 11-119915001 | |
Salmon sperm (sonicated to around 100bp) | Sigma | D1626 | |
TE pH 8.0 | gereral lab supplier | ||
Antibodies (ChIP grade if possible) | |||
anti-RNA Pol II [8WG16] | abcam | ab817 | |
anti-Histon H3K36me3 | abcam | ab9050 | |
or antibody of interest | |||
Buffers | |||
Binding/Blocking buffer | Store at RT | PBS with 0.5 % BSA and 0.5 % Tween 20 | |
Cell-Lysis buffer | Store at RT | 5 mM Pipes [pH 8.0], 85 mM KCl, and 0.5 % NP40 | |
ChIP IP buffer | Store at RT | 0.01 % SDS; 1. 1% Triton X-100;1.2 mM EDTA; 16.7 mM Tris-HCl, pH 8.1; 16.7 mM NaCl | |
Elution buffer | Store at RT up to 6 months | 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 5 mM EDTA (pH 8.0), 300 mM NaCl and 0.5 % SDS | |
Nuclei-Lysis buffer | Store at RT | 50 mM Tris [pH 8.0], 10 mM EDTA, and 1 % SDS | |
Wash buffer I | Store at RT | 0.1 % SDS; 1 % Triton X-100; 2 mM EDTA; 20mM Tris-HCL pH 8.1; 150 mM NaCl | |
Wash buffer II | Store at RT | 0.1 % SDS; 1 % Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris-HCL pH 8.1; 500 mM NaCl | |
Wash buffer III | Store at RT | 0.25 M LiCl; 1% NP-40; 1 mM EDTA; 10 mM Tris-HCl, pH 8.1 | |
Equipment | |||
2100 Bioanalyzer instrument | Agilent | G2939BA | use this instrument for electrophoretical analysis |
Nanodrop | Thermo Scientific | ||
Bioruptor TBX microtubes 1.5 ml | Diagenode | C30010010 | |
or tubes special for your sonication device | |||
Bioruptor sonication device or sonication device of your choice | Sonication of T cells with Bioruptor: 20 – 25 cycles (30 s on, 30 s off at high in two 1.5 ml bioruptor microtubes with 500 µl each tube) | ||
Magnetic stand for tubes | |||
Thermomixer | |||
Agarose gel electrophoresis | |||
Qubit Fluorometer | Thermo Scientific | Use this Fluorometer for quantifying low amounts of RNA/DNA |