हम synthesizing की एक विधि का वर्णन संगत 10-एनएम गोल्ड नैनोकणों, सतह पर कोटिंग पाली-ईथीलीन ग्लाइकोल द्वारा कार्यात्मक । इन कणों विट्रो में और नेनो सेलुलर और extracellular रिक्त स्थान है कि पारंपरिक nanoparticle आकार के साथ उपयोग करने के लिए मुश्किल है चिकित्सा देने के लिए vivo में इस्तेमाल किया जा सकता है ।
गोल्ड नैनोकणों (AuNPs) चिकित्सा अनुसंधान में बड़े पैमाने पर उनके आकार, जैव अनुकूलता, और परिवर्तनीय सतह के कारण इस्तेमाल किया गया है । विशिष्ट लक्ष्यीकरण और दवा वितरण इन AuNPs के आवेदनों में से कुछ हैं, लेकिन endothelial extracellular ‘ मैट्रिक्स रक्षात्मक गुण बाधा कण को ले लो । इस समस्या को हल करने के लिए, हम ultrasmall गोल्ड नैनोकणों के लिए एक संश्लेषण विधि का वर्णन संवहनी वितरण में सुधार करने के लिए, अनुकूलन योग्य कार्यात्मक समूहों और आगे समायोजन के लिए बहुलक लंबाई के साथ. प्रोटोकॉल पैदावार २.५ एनएम AuNPs कि tetrakis (hydroxymethyl) phosphonium क्लोराइड (THPC) के साथ छाया हुआ है । AuNP की सतह पर hetero कार्यात्मक पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) के साथ THPC के प्रतिस्थापन १०.५ एनएम के लिए hydrodynamic त्रिज्या बढ़ जाती है, जबकि सतह पर विभिंन कार्यात्मक समूहों प्रदान करते हैं । प्रोटोकॉल के पिछले भाग में एक fluorophore के वैकल्पिक अतिरिक्त शामिल करने के लिए AuNPs प्रतिदीप्ति ट्रैक करने के लिए nanoparticle के तहत visualized की अनुमति है । AuNPs को शुद्ध और अलग करने के लिए डायलिसिस और lyophilization का प्रयोग किया गया । इन फ्लोरोसेंट नैनोकणों दोनों विट्रो में और vivo में प्रयोगों के कारण में visualized किया जा सकता है-संगत खूंटी कोटिंग और फ्लोरोसेंट जांच । इसके अतिरिक्त, इन नैनोकणों के आकार रेंज उंहें सामांय vasculature समारोह में खलल न डालें बिना glycocalyx जांच के लिए एक आदर्श उंमीदवार प्रदान, जो बेहतर प्रसव और चिकित्सीय उपचार के लिए नेतृत्व कर सकते हैं ।
नैनोकणों अपने शरीर के माध्यम से नेविगेट करने की क्षमता के लिए दवा वितरण और इमेजिंग करने के लिए लागू किया गया है के लिए ब्याज1,2के लक्ष्य क्षेत्रों तक पहुंचने । कणों टपका हुआ vasculature के माध्यम से ट्यूमर के भीतर जमा हो सकता है या स्थानीयकरण जहां एक लक्ष्य ligand और स्पष्ट रूप से उजागर है । सोने, विशेष रूप से, क्योंकि अपनी अनूठी रासायनिक और भौतिक गुण है कि परिवहन और चिकित्सीय3के रिलीज को प्रभावित की एक सामांय रूप से इस्तेमाल किया nanoparticle सामग्री बन गया है । सोने की एक प्रभावी nanoparticle सामग्री है क्योंकि इसकी सतह को thiols से बांध संशोधित किया जा सकता है और उच्च अपनी कम विषाक्तता के कारण असंगति है4। AuNPs बड़े आणविक दवाओं के वाहक होने में सक्षम हैं और पेप्टाइड्स, न्यूक्लिक एसिड, और प्रोटीन देने में सफल रहे हैं, AuNPs2,4लक्ष्यीकरण के लिए अनुकूल होने की अनुमति ।
दुर्भाग्य से, nanoparticle दवा वितरण प्रभावशीलता नकारात्मक आरोप लगाया glycocalyx, जो सबसे स्तनधारी कोशिकाओं की झिल्ली पर extracellular कोट है और 7 एनएम5,6तक का आकार ताकना है द्वारा बाधा उत्पंन किया गया है । इस ताकना आकार सबसे nanoparticle दवा वाहक है, जो ठेठ 50-200 एनएम से लेकर व्यास है से छोटा है । रोग की स्थिति के तहत, इन glycocalyx pores बड़ा क्षरण के कारण हो, endothelial कोशिकाओं के माध्यम से पारगम्यता बढ़ रही है । हालांकि, सबसे नैनोकणों अभी भी glycocalyx में इस संरचनात्मक परिवर्तन का लाभ लेने के लिए बहुत बड़े हैं । इस आकार बेमेल का एक निहितार्थ यह है कि पारंपरिक आकार के कणों endothelial कोशिकाओं है कि लाइन रक्त वाहिकाओं के साथ अनुकूल बातचीत नहीं है । यह endothelium में नसों में प्रशासित कणों की डिलीवरी को प्रभावित करता है, और यह भी रक्त मस्तिष्क बाधा7,8,9,10के माध्यम से कण परिवहन के बारे में कहा जा सकता है ।
एक दृष्टिकोण इस मुद्दे का मुकाबला करने के लिए छोटे कणों का उपयोग करने के लिए glycocalyx में छोटी pores के माध्यम से पारित है । यहां, हम एक १०.५ एनएम ultrasmall गोल्ड nanoparticle, जो आम तौर पर बरकरार, स्वस्थ glycocalyx से भयभीत किया जाना चाहिए संश्लेषित । एक बार glycocalyx के लिए समझौता हो शुरू होता है, nanoparticle आसानी से बढ़ती ताकना आकार के माध्यम से कोशिकाओं घुसना चाहिए । इस पत्र में प्रोटोकॉल का विवरण ultrasmall गोल्ड कोर का संश्लेषण खूंटी के साथ लेपित, जो कि असंगति को बढ़ाता है और प्रणालीगत क्लीयरेंस को कम करता है4. खूंटी भी कार्यात्मक समूहों के कई प्रकार शामिल कर सकते हैं, लाइगैंडों, fluorophores लक्ष्यीकरण के विकार के लिए रास्ते खोलने, और चिकित्सकीय । पहले प्रकाशित परिणाम संकेत मिलता है कि इन ultrasmall नैनोकणों के लिए कर रहे है और अधिक इष्ट को बाधित endothelial glycocalyx समारोह के क्षेत्रों में भी किसी भी सक्रिय लक्ष्यीकरण4,11के बिना लिया । यह व्यवहार्यता और वितरण अनुप्रयोगों के लिए सही आकार के कणों के उपयोग के महत्व को इंगित करता है । निंनलिखित प्रोटोकॉल संश्लेषण, शुद्धि और खूंटी लेपित AuNPs (खूंटी-AuNP) के लक्षण वर्णन, कार्यात्मक समूहों और अंय अनुप्रयोगों के लिए conjugations सिलाई के लिए चर्चा के साथ प्रस्तुत करता है ।
इस तकनीक synthesizing अनुकूलन, ultrasmall खूंटी लेपित AuNPs के लिए एक प्रभावी तरीका है । इस प्रक्रिया का एक महत्वपूर्ण हिस्सा है THPC छाया गोल्ड नैनोकणों, जो पीले रंग से भूरा है कि HAuCl4 दौर नीचे कुप्पी (प्रोटोकॉल कदम २.३) में सामग्री के लिए जोड़ दिया गया है के बाद घटित होगा की पुष्टि कर सकते है के प्रारंभिक गठन है । कोई रंग परिवर्तन इंगित करता है कि कोई नैनोकणों का गठन नहीं है और कि प्रारंभिक चरणों की जांच और आगे बढ़ने से पहले दोहराया जाना चाहिए । मामले में रंग शराब लाल या ग्रे जैसे ब्राउन के अलावा कुछ करने के लिए बदल जाता है, जिसके परिणामस्वरूप कणों की संभावना लक्ष्य २.५ एनएम के आसपास नहीं होगा और एक नया बैच के रूप में अच्छी तरह से किया जाना चाहिए ।
गोल्ड कोर के गठन के बाद, खूंटी के लिए THPC के आदान प्रदान और शुद्धि प्रक्रियाओं प्रोटोकॉल के सफल समापन के लिए कई महत्वपूर्ण कदम होते हैं । मिश्रण रातोंरात प्रतिस्थापन प्रतिक्रिया के लिए पूरा करने के लिए जाने के लिए अनुमति देता है । असफल शुद्धि यदि डायलिसिस पानी निर्धारित आवृत्ति के साथ नहीं बदला है हो सकता है । कणों के ७२ से अधिक के लिए डायलिसिस में छोड़ दिया जाता है, तो एकत्रीकरण और कणों का वर्षण भी हो सकता है । स्थिर सुखाने के दौरान अंय संभावित समस्याएं देखी जा सकती हैं । ultrasmall खूंटी लेपित AuNP समाधान पूरी तरह से जम नहीं था या यदि lyophilizer सही रूप से सेट नहीं किया गया था, तो नमूने खो सकते हैं । lyophilizer मैनुअल को देखें, के रूप में कुछ उपकरणों के विभिंन नमूना तैयारी की आवश्यकता हो सकती है ।
संश्लेषण की आसानी और जिसके परिणामस्वरूप कणों की असंगति इन खूंटी-AuNPs उपयोग करने के लिए लाभ का प्रतिनिधित्व करते हैं । इसके अलावा, इन नैनोकणों को नेनो सेलुलर संरचनाओं के साथ बातचीत करने के रूप में इन नैनोकणों के ऊपर से नीचा glycocalyx की पहचान करने की क्षमता के द्वारा प्रदर्शित करने में सक्षम होने का लाभ है । यह लाभ नए atherosclerosis उपचारों और निवारक उपायों के विकास के लिए leveraged किया जा सकता है । परे क्या हम यहां मौजूद, इस प्रोटोकॉल का एक और लाभ यह है कि यह कणों के व्यापक अनुकूलन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से वृद्धि हुई स्थिरता और भंडारण क्षमताओं सोने नैनोकणों4पर खूंटी युक्त thiol संलग्न द्वारा की अनुमति देता है । खूंटी श्रृंखला के दूसरे छोर किसी भी कार्यात्मक समूह में शामिल कर सकते हैं, और अणुओं के असंख्य उन समूहों के लिए संयुग्मित जा सकता है । इस प्रोटोकॉल में, सभी तीन सामांय कार्यशील समूह (मिथाइल, carboxyl, और अमीनो) अनुलग्न हैं । खूंटी का अनुपात पहले फ्लोरोसेंट पहचान को प्राथमिकता के लिए चुना जाता है, तो carboxylic एसिड समूह का उपयोग कर एक माध्यमिक लक्ष्यीकरण moiety को शामिल करने की क्षमता. इन समूहों के अनुपात आवेदन के आधार पर tweaked किया जा सकता है, और लंबाई और पॉलिमर के आकार के रूप में अच्छी तरह से समायोजित किया जा सकता है ।
कण तेज को मापने के लिए, हम कार्यात्मक समूहों में से एक के लिए एक फ्लोरोसेंट जांच संयुग्मित । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि हम क्या वर्णित है परे किसी भी विकार nanoparticle की सतह के गुणों का एक परिवर्तन में परिणाम होगा । अतिरिक्त घटकों और विकार प्रतिक्रियाओं के संबंध में नैनोकणों के प्रत्येक पुनरावृत्ति वांछित गुणों के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए ।
इस विधि ultrasmall सोने नैनोकणों endothelial extracellular glycocalyx है, जो पारंपरिक आकार नैनोकणों के ऊपर बाधा उत्पंन की रक्षात्मक गुणों को दूर करने का इरादा पैदा करता है । हालांकि, छोटे आकार दोनों इमेजिंग और दवा लोडिंग पहलू में कठिनाई के लिए उधार देता है । इन कणों ठेठ nanoparticle आकार सीमा से काफी छोटे हैं, और एक परिणाम के रूप में चिकित्सकीय और लक्ष्यीकरण moieties के अनुलग्नकों के लिए उपलब्ध सतह क्षेत्र बहुत कम है । इस कठिनाई इमेजिंग अनुप्रयोगों में उठा व्यक्तिगत संकेतों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, हालांकि कणों के समूहों अभी भी आसानी से पहचाना जा सकता है, के रूप में फोकल छवियों में दिखाया गया है । लक्ष्यीकरण लाइगैंडों और चिकित्सीय के अनुलग्नकों के लिए कम सतह लक्ष्य खुराक आवश्यकताओं को प्राप्त करने के लिए प्रशासित किया जा करने के लिए और अधिक कणों की आवश्यकता हो सकती है. हालांकि, छोटे कणों को जब ध्यान में glycocalyx लेने के वितरण में अधिक कुशल हो जाएगा ।
ये उपंयास ultrasmall कणों microenvironment के ंयूनतम व्यवधान के साथ शरीर के भीतर नेनो क्षेत्रों तक पहुंचने के लिए मुश्किल में प्रसव के लिए सक्षम हैं । खूंटी के अलावा वृद्धि हुई है और अधिक अनुकूलता के लिए कणों के भारी अनुकूलन के लिए कार्यात्मक समूह प्रदान करता है के लिए अनुमति देता है । ठेठ नैनोकणों की तुलना में छोटे आकार कुछ कमियों के साथ आता है, लेकिन अगर रणनीतिक विकसित, ultrasmall कण मुश्किल के आवास के लिए एक होनहार दृष्टिकोण है घुसना, जटिल, और कमजोर नाड़ी में glycocalyx लक्ष्यीकरण और दवा वितरण ।
The authors have nothing to disclose.
इस कार्य को पूर्वोत्तर विश्वविद्यालय केमिकल इंजीनियरिंग विभाग, स्टार्ट-अप फंडों और पूर्वोत्तर विश्वविद्यालय प्रोवोस्ट कार्यालय से टियर 1 प्रायोगिक अध्ययन अनुदान, NIH K01 HL125499, और NSF-IGERT ग्रांट NSF/डीजीई-096843 द्वारा समर्थित किया गया था । लेखक भी थॉमस जे Webster और उनकी सहायता के लिए उनकी प्रयोगशाला के रूप में के रूप में अच्छी तरह से Nanomedicine विज्ञान और प्रौद्योगिकी केंद्र और पूर्वोत्तर विश्वविद्यालय में दवा विज्ञान विभाग का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।
Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma Aldrich | 795429 | |
Gold (III) Chloride trihydrate (HAuCl4.3H2O) | Sigma Aldrich | 520918 | |
Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
Tetrakis (hydroxymethyl) phosphnium chloride | Sigma Aldrich | 404861 | |
Mono-functional mPEG-thiol | Layson Bio Inc. | MPEG-SH-2000-1g | Mw: 2,000 Da |
hetero bi-functional anime-PEG-thiol | Layson Bio Inc. | NH2-PEG-SH-3400-1g | Mw: 3,400 Da |
Carboxymethyl-PEG-thiol | Layson Bio Inc. | CM-PEG-SH-2000-1g | Mw: 2,000 Da |
Cellulose dialysis membrane (12-14 kDa) | Sigma Aldrich | D9777 | |
Zerostat anti-static instrument | Sigma Aldrich | Z108812 | |
Alexa Fluor 647 (AF647) carboxylic acid succinimidyl ester | Fisher | A20006 | Fluorophore |
Fisherbrand Qualitative Grade Plain Filter Paper Circles – P5 grade | Thermo Fisher Scientific | 09-801-B | |
Transmission electron microscopy | JEOL USA | JEOL JEM-1000 | TEM |
Dynamic Light Scattering | Brookhaven Instruments Corporation | Brookhaven 90 Plus Particle Size Analyzer | DLS |
Fluorometer | Horiba Scientific | Jobin Yvon Fluromax 4 | Fluorometer |
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) | Promega | G3582 | MTS |
Plate reader | Molecular Devices | SpectraMax M4 | Plate reader |
10E4 epitope HS mouse monoclonal IgM antibody (primary antibody) | Amsbio | 370255 | Primary antibody |
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (secondary antibody) | Thermo Fisher Scientific | R37120 | Secondary antibody |
VECTASHIELD mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1000 | With DAPI |
Confocal Microscope | Carl Zeiss Meditex AG | Zeiss LSM 700 | Confocol microscopy |