Method Article

순환 종양 세포 시각화 폐 조직에 대 한 폐 식민 분석 결과의 설립

DOI:

10.3791/56761

⸱

June 16th, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The Institute of Basic Medical Sciences, College of Medicine, National Cheng Kung University, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Medicine, National Cheng Kung University, 3Trauma Office, Children's National Health System

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

순환 종양 세포 (CTCs) 암 전이 동안 폐 식민을 촉진 역할을 해독 하는 동물 모델 필요 합니다. 여기, 우리가 설립 하 고 성공적으로 수행는 vivo에서 시험의 구체적으로 테스트를 폐 식민 CTCs에 고분자 fibronectin (polyFN) 어셈블리의 요구.

Abstract

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전이 암 사망의 주요 원인입니다. 순환 종양 세포 (CTCs) 암 전이, 폐 식민 CTCs에 의해 비판적으로 공헌 한다 폐 전이성 프로세스 초기에 홍보에 역할을 적극적으로 조사 되었습니다. 따라서, 동물 모델은 유일한 접근 전이의 전체 조직의 프로세스를. 우리는 vivo에서 폐 식민 분석 결과 설립 문제가 혈관 넘쳐 흐름 CTCs의 기여를 조사 하기 위한 이전 실험 설계에서 발생, 그 긴 장기 형광 세포 추적 프로그램, carboxyfluorescein 그리고 에스테 르 succinimidyl (CFSE), 일시 중단 된 종양 세포를 사용 폐 관류 폐 제거, confocal 영상 및 정량화 이전 비 특히 갇혀 CTCs를 수행 했다. CTC 표면에 고분자 fibronectin (polyFN) 전이성 종양 조직의 최종 설립에 폐 식민 중재 발견 되었습니다. 여기, 특히 polyFN 어셈블리 CTCs에 폐 식민 넘쳐 흐름의 요구 사항을 테스트, 단기 수행 있는 폐 식민 분석 실험 중단 루이스 폐 암 세포 (LLCs) 안정적으로 FN-shRNA (shFN)를 표현 하거나 출 격-shRNA (shScr)와 20 미리 레이블이 CFSE의 μ M C57BL/6 쥐로 정 맥 주사 했다. 우리는 성공적으로 마우스 폐를 식민지로 shFN LLC는 세포의 능력 shScr LLC 셀에 비해 현저 하 게 점감 되었다 설명 했다. 따라서,이 단기 방법론 특히 식민지 폐 순환 내 CTCs의 능력을 보여 주기 위해 널리 적용할 수 있습니다.

Introduction

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전이 암 죽음1,2의 주요 원인입니다. 기본 조직에서 파생 하는 종양 세포에에서 순환을 입력 하 고 전에 그들은 다양 한 hematogenous 도전, 예를 들면, anoikis, 면역 공격, 및 혈압 또는 기하학적 구속 조건에서 전단 응력으로 인해 손해 생존 식민지 먼 장기 전이3,4,,56의 성공을 지시 된 중요 한 단계를 수 있습니다. 순환 종양 세포 (CTCs) 특성화 및 종양 악성 종양, 전이, 암 환자7,8 의 생존 율과 이러한 특성을 상호 활발 한 노력에 현재 되었습니다 따라서, , 9. 암 전이의 과정 vivo에서 이벤트를 구체적으로 묘사, 동물 모델은 유일한 접근 전이10,

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Protocol

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모든 실험 쥐에 우리의 연구소 (관리 및 실험 동물의 사용, NCKU 의학 대학에 대 한 가이드)의 지침에 따라 수행 했다.

1. 악기, 문화 미디어, 및 요리 준비

  1. 시작 하기 전에 실험 프로토콜, 메 마른 외과 봉합, 1 mL 주사기 26 G/0.5 c m 바늘 (대 한 꼬리 정 맥 주사), 얻을 3 mL 주사기 24 G/3 c m 바늘 (대 한 폐 관류), Dulbecco의 수정이 글 미디어 (DMEM), 트립 신-EDTA 솔루션 (5 g/L 트립 신 및 0.53 m m), 소 태아 혈 청 (FBS), 1 x PBS (137 m NaCl m, 2.7 m m KCl, 10mm 나2포4및 1.8 m m KH2포4), 그리고 6 cm 문화 요리.

2. 준비 및 서 스 펜 션에 종양 세포의 복구

  1. 살 균 Dulbecco의 수정이 글 미디어 (DMEM) 10% 또는 20% 포함 된 준비 FBS 갓 추가 2mm L-글루타민, 1 x PBS, 0.05% 트립 신-EDTA.
  2. 10% 보충 DMEM 셀 문화 37 ° C에서 FBS 문화 접시에 70-80% 합류 있을 때....

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Results

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Vivo에서 폐 식민 분석 결과 수행 하기 전에 일시 중단 된 종양 세포에 polyFN 중재 폐 식민지 그리고/또한 전이, 촉진에 넘쳐 흐름 여부를 테스트 하려면 그림 1A 에서 볼 수 있듯이 우리가 먼저 적정 다른 CFSE, 세포 투과성 covalently 세포내 포함 하는 아민 분자26,27 일시 중단 된 종양 세포에 변화 하 고 꽤 긴 시간 동안 셀에 남아 형광 화합물 농도 우리는 그 종양 세포에 그림된 그림 1B와 복용량 의존 방식에서 CFSE와 효과적으로 표시 했다 발견. CFSE 라벨 6에서 그림 1 c에 나와 있는5 LLC 셀/mL는 거의 20 µ M로에 대 지.......

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Discussion

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긴 기간 폐 식민 분석 실험, 단기 우리 고용 여기 먼 장기에 폐 식민 CTCs에 의해 vivo에서 평가 하는 방법론 명확 하 게 발표 하 고 식민지에서 CTCs에 조립 하는 polyFN의 특정 역할 분화와 함께 폐에 넘쳐 흐름 및 전이성 프로세스18,19,,2021다음 주도. 비록 장기 셀 추적기 CFSE 3 일전 폐 관류에 대 한 정 맥 주입된 CTCs를 추적 하 고 양적으로 충분 한 녹색 형광을 유지 하는 셀 라벨, 그건 직접 확인할 수 종양 세포 배 루멘 내 위치 여부 이미 혈관에서 extravasated. 이 문제, 빨간색 형광을 해결 하기 위해 rhodamine 활용 된 dextran lectins endothelia에에 비 특정 바인딩 할 수 있는 폐 관류

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Disclosures

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저자는 공개 없다.

Acknowledgements

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저자 박사 Ming 분 장 및 양 나중 Hsin 쳉 그들의 기술 지원에 감사 하 고 싶습니다. 이 작품만 사역의 과학 및 기술에 의해 지원 되었다 (대부분-103-2325-B-006-009, 대부분-104-2325-B-006-001, 대부분-105-2325-B-006-001, 및 MOST-106-2320-B-006-068-MY3)의 보건 및 복지 (MOHW106-TDU-B-211-144004). 우리는 또한 그들의 다 광자 공초점 현미경에 대 한 국립 쳉 쿵 대학, 의학 대학의 핵심 연구소에서 지원에 대 한 감사.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Material
소 세럼 알부민 ( BSA)Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan)101-9048-46-8
Bouin's FluidMCC(Medical Chemical Corporation)/POISON456-A-1GL
CFSE Proliferation Dyeebiosciences65-0850-85성명: Carboxyfluorescein succinimidyl ester
Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM) (Gibco)ThermoFisher Scientific12100-061
에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)Cyrusbioscience (타이페이, 대만)101-6381-92-6준비된 트립신-EDTA 용액( 최종 농도: 0.53mM) 
태아 소 혈청 (FBS)(Gibco)ThermoFisher Scientific10437-028
Lewis lung carcinoma (LLC)ATCC, Manassas, VA, USACRL-1642
L-Glutamine, USP (Gibco)ThermoFisher Scientific21051-024
염화칼륨 (KCl)Cyrusbioscience (타이페이, 대만)101-7447-40-7준비된 1X PBS (최종 농도: 2.7mM)
인산칼륨 일염기성 (KH2PO4)Cyrusbioscience (타이페이, 대만)101-7778-77-0준비된 1X PBS (최종 농도: 1.8mM)
나트륨 염화물(NaCl)Cyrusbioscience(대만 타이베이101-7647-14-5준비된 1X PBS(최종 농도: 137mM)
산나트륨이염기성(Na2HPO4)Cyrusbioscience(대만 타이베이)101-10039-32-4준비된 1X PBS(최종 농도: 10mM)
Trypan BlueSigma AldrichT61460.5g과 100mL 1X PBS
혼합TrypsinSigma AldrichT4799준비된 트립신-EDTA 용액 (최종 농도: 5g/L)
Zoletil 50Virbac1X PBS로 희석하기 위해 
NameCompany카탈로그 번호Comments
Equipment
Compact 탁상용 원심분리기 2420KUBOTA Co.2420
배양 접시 (6cm)무석 NEST 생명 공학 Co.
일회용 주사기 (바늘 포함)Perfect Medical Industry Co.24G/3 cm;3 ml & 26G/0.5 cm;1 ml
엔드 오버 엔드 믹서C.T.I YOUNG CHENNTS-20부유 세포 회수용 
FACSCalibur (FACS)BD biosciences
ForcepsDimeda10.102.14
Forma Direct Heat CO2 인큐베이터Thermo Fisher Scientific Inc.HEPA CLASS 100
마우스 억제기 (원통형 억제기 15-30 gm)Stoelting51338
다광자 컨포칼 현미경 BX61WIOlympusFV1000MPE
Neubauer 계수실Marienfeld-Superior640010
수술용 가위Dimeda08.370.11
수술용 봉합사 UNIK 외과 봉합사 MFG. CO.NO. 0034블랙 브레이드 실크; 비흡수성(25YD; U.S.P. 4/0)
1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브Wuxi NEST Biotechnology Co.
15 mL Greiner 튜브Greiner bio-one188271
)인705001615001

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Massague, J., Obenauf, A. C. Metastatic colonization by circulating tumour cells. Nature. 529 (7586), 298-306 (2016).
  2. Lambert, A. W., Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. Emerging Biological Principles of Metastasis. Cell. 168 (4), 670-691 (2017).
  3. Mohme, M., Riethdorf, S., Pantel, K.

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Lung Colonization AssayCirculating Tumor CellsCFSE LabelingLung PerfusionConfocal MicroscopyFibronectin AssemblyLewis Lung CarcinomaIntravenous InoculationC57BL 6 MiceFluorescence Imaging

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