Создание основной культуры саркомы мягких тканей, пациент производные
Summary
Следующий протокол фокусируется на создании основной культуры саркомы мягких тканей, пациент производные (STS). Эта модель может помочь нам лучше понять молекулярных фон и фармакологические профиль этих редких злокачественных опухолей и может стать отправной точкой для дальнейших исследований, направленных на совершенствование управления STS.
Abstract
Сарком мягких тканей (STS) представляют спектр гетерогенных злокачественных опухолей с сложный диагноз, классификации и управления. К настоящему времени было выявлено более чем 50 гистологических подтипов этих редких солидных опухолей. Таким образом ввиду их чрезвычайного разнообразия и низкий уровень заболеваемости, наше понимание биологии этих опухолей по-прежнему ограничен. Пациент производные культуры представляют собой идеальную платформу для изучения патофизиологии STS и фармакологии. Таким образом мы разработали человека доклинических модель STS, начиная от опухоли образцы заготавливаемым от пациентов, перенесших хирургической резекции. Пациент производные STS клеточных культур были получены от хирургического образцов коллагеназы пищеварение и изоляции путем фильтрации. Клетки были подсчитаны, семенами и оставили на 14 дней в стандартных монослоя культур и затем обрабатывается течению анализа. Прежде чем выполнять молекулярные или фармацевтического анализа, создание STS первичных культур было подтверждено путем оценки cytomorphologic функций и, при наличии, иммуногистохимических маркеров. Этот метод представляет собой полезный инструмент 1) для изучения естественной истории эти плохо изучены злокачественных опухолей и 2) для проверки воздействия различных наркотиков в попытке узнать больше об их механизмов действий.
Introduction
Сарком мягких тканей (STS) включают в себя спектр гетерогенных поражения мезенхимальных происхождения приходится 1% всех твердых опухолей1,2, и новой классификации Всемирной организации здравоохранения признает наличие более чем 50 3различные подтипы. Среди них наиболее распространенными histotypes являются Адипоцит саркома или липосаркома и лейомиосаркома, приходится 15% и 11% всех взрослых STS, соответственно4,5. Хотя STS может развиваться в различных частях тела, конечностей и retroperitoneum являются наиболее распространенными сайты, происходящих в 60% и 20% случаев, соответственно6.
Краеугольным камнем терапии для локализованных болезни является широкая хирургической резекции, тогда как преимущества адъювантов и неоадъювантной химиотерапии остаются неясными и рассматриваются только в отдельных случаях7. В параметре метастазами, химиотерапии является стандарт медицинской помощи, но показывает ограниченные результаты8. Лучшего понимания молекулярной биологии STS поможет улучшить текущий дифференциальной диагностики, оптимизации имеющихся методов лечения и выявления новых мишеней для терапии.
В этом контексте исследования рака была выполнена в течение многих лет с помощью увековечен клеток линии9. Эти экспериментальные модели обычно культивировали в стандартных монослоя поддерживает или имплантируется в иммунодефицитных грызунов учредить в vivo ксенотрансплантата моделей10. Увековечен клеточных линий представляют управляемой и легкий к магазине материал, с которым могут выполняться достаточное количество научных экспериментов. Они являются, по сути, наименее дорогостоящим и наиболее широко используемым инструментом в доклинических исследованиях11.
Однако на основе линии клетки рака модели также имеют некоторые ограничения, например продлен культуры в системе монослоя вместе с все большее число проходов индуцирует фенотипических и генетического дрейфа, изготовление клеток менее вероятно резюмировать ключевые опухоли особенности. Кроме того культуры клеток линии не воспроизводить взаимодействие в ячейке и сигнальной молекулы перекрестных помех, которые имитируют биологического поведение опухоли и характеризуют микроокружения опухоли. Эти вопросы образуют основу разрыв, существующий между доклинические и клинические результаты12.
Учитывая вышесказанное,13возрос интерес к пациенту, полученных первичных культур. Действительно эксцизии злокачественных и нормальной ткани, снижает риск потерять фенотипа клетки рака и неоднородности, таким образом предлагая исходного материала, который является более представительным микроокружения опухоли. Кроме того использование свежих опухоли образцов заготавливаемым от пациентов, перенесших хирургическая резекция позволяет нам исследовать один опухоли и сравнить различные поражения от той же части тела пациента в14. По указанным выше причинам культуры клеток ткани производные обеспечивают ценный материал для изучения опухоли патофизиологии и фармакологии15,16,17, особенно в STS в котором коммерчески доступных саркома клеточных линий являются ограниченный18. Таким образом, мы оптимизировали метод, чтобы установить пациента производный STS первичной культуре клеток начиная с хирургическим подакцизным опухоль ткани13,19,20. Наш метод состоит из разбивки образца тумора в небольшие фрагменты тканей следуют ночи диссоциации ферментативные ткани для получения одной ячейки подвеска. На следующий день, ферментативного пищеварения остановлена, добавляя свежий культуры средств массовой информации и полученных подвеска фильтруется, чтобы удалить фрагменты тканей, клеток агрегаты и избыток матрица материала или мусора. Наконец часть изолированного опухолевых клеток является cytospinned на стеклянных вставках, фиксированной и хранится вниз по течению анализа, направленного на подтверждение создания STS основной культуры Цитоморфологическое, иммуногистохимических и молекулярных цитогенетических оценки (например рыбы анализ MDM2 амплификации представляет стандартный дифференциальной диагностики для хорошо дифференцированная липосаркома и Дедифференцированная липосаркома) 4. остальные ячейки будут посеяны в стандартной монослойном культивировании ген выражение профилирования и фармакологических исследований. Все эксперименты проводятся с использованием низких проход первичных культур, чтобы избежать выбора конкретных рака subclones и проанализированы саркома опытных патологоанатом. Таким образом, мы создали полностью человека STS экс vivo модель13,19,20. Это очень универсальный, легко ручка модель может стать полезным инструментом для различных типов доклинических исследований, например для выявления новых молекулярных маркеров для диагностики и прогноза или получить более глубокого понимания деятельности и механизмы действие, стандартных и новых препаратов, используемых в управлении STS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Четко определены доклинических модели необходимы для прояснения молекулярных фон опухоли, предсказать плохой прогноз и развивать новые терапевтические стратегии для больных раком. Это особенно важно для редких опухолей, таких как STS, чья высокая неоднородность морфологии, агрессивно…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Грайне Тирни для редакционной помощи.
Materials
| DMEM High Glucose | EuroClone | ECB7501L | |
| Fetal bovine serum | EuroClone | ECS0180D | |
| Glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| Paraformaldehyde 4% aqueous solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences | 157-4-100 | |
| Penicillin streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Triazol reagent | Ambion Life-Technologies | 15596018 | |
| Trypsin | EuroClone | ECB3052D |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 66 (1), 7-30 (2016).
- Linch, M., Miah, A. B., Thway, K., Judson, I. R., Benson, C. Systemic treatment of soft-tissue sarcoma gold standard and novel therapies. Nat Rev Clin Oncol. 11 (4), 187-202 (2014).
- Fletcher, C. D. The evolving classification of soft tissue tumours – an update based on the new 2013 WHO classification. Histopathology. 64 (1), 2-11 (2014).
- De Vita, A., et al. Current classification, treatment options, and new perspectives in the management of adipocytic sarcomas. Onco Targets Ther. 9 (12), 6233-6246 (2016).
- Recine, F., et al. Update on the role of trabectedin in the treatment of intractable soft tissue sarcomas. Onco Targets Ther. 10, 1155-1164 (2017).
- Ducimetière, F., et al. Incidence of sarcoma histotypes and molecular subtypes in a prospective epidemiological study with central pathology review and molecular testing. PLoS One. 6 (8), 20294 (2011).
- Nussbaum, D. P., et al. Preoperative or postoperative radiotherapy versus surgery alone for retroperitoneal sarcoma: a case-control, propensity score-matched analysis of a nationwide clinical oncology database. Lancet Oncol. 17 (7), 966-975 (2016).
- The ESMO/European Sarcoma Network Working Group. Soft tissue and visceral sarcomas: ESMO clinical practice guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol. 25, 102-112 (2014).
- Paul, J. The Cancer Cell in Vitro: A Review. 암 연구학. 22, 431-440 (1962).
- Morton, C. L., Houghton, P. J. Establishment of human tumor xenografts in immunodeficient mice. Nat Protoc. 2 (2), 247-250 (2007).
- Centenera, M. M., Raj, G. V., Knudsen, K. E., Tilley, W. D., Butler, L. M. Ex vivo culture of human prostate tissue and drug development. Nat Rev Urol. 10 (8), 483-487 (2013).
- Vannucci, L. Stroma as an Active Player in the Development of the Tumor Microenvironment. Cancer Microenviron. 8 (3), 159-166 (2015).
- De Vita, A., et al. Activity of Eribulin in a Primary Culture of Well-Differentiated/Dedifferentiated Adipocytic Sarcoma. Molecules. 3 (12), 1662 (2016).
- Failli, A., et al. The challenge of culturing human colorectal tumor cells: establishment of a cell culture model by the comparison of different methodological approaches. Tumori. 95 (3), 343-347 (2009).
- Steinstraesser, L., et al. Establishment of a primary human sarcoma model in athymic nude mice. Hum. Cell. 23, 50-57 (2010).
- Raouf, A., Sun, Y. J. In vitro methods to culture primary human breast epithelial cells. Methods Mol. Biol. 946, 363-381 (2013).
- Daigeler, A. Heterogeneous in vitro effects of doxorubicin on gene expression in primary human liposarcoma cultures. BMC Cancer. 29, 313 (2008).
- Pan, X., Yoshida, A., Kawai, A., Kondo, T. Current status of publicly available sarcoma cell lines for use in proteomic studies. Expert Rev Proteomics. 13 (2), 227-240 (2016).
- Liverani, C., et al. Innovative approaches to establish and characterize primary cultures: an ex vivo. 3D system and the zebrafish model. Biol Open. 15 (2), 309 (2017).
- De Vita, A., et al. Myxofibrosarcoma primary cultures: molecular and pharmacological profile. Ther Adv Med Oncol. 9 (12), 755-767 (2017).
- Blay, J. Y., Ray-Coquard, I. Sarcoma in 2016: Evolving biological understanding and treatment of sarcomas. Nat Rev Clin Oncol. 14 (2), 78-80 (2017).
- Dairkee, S. H., Deng, G., Stampfer, M. R., Waldman, F. M., Smith, H. S. Selective cell culture of primary breast carcinoma. Cancer Res. 55 (12), 2516-2519 (1995).
- Kar, R., Sharma, C., Sen, S., Jain, S. K., Gupta, S. D., Singh, N. Response of primary culture of human ovarian cancer cells to chemotherapy: In vitro individualized therapy. J Cancer Res Ther. 12 (2), 1050-1055 (2016).
- Ravi, A., et al. Proliferation and Tumorigenesis of a Murine Sarcoma Cell Line in the Absence of DICER1. Cancer Cell. 21 (6), 848-855 (2012).
- Zhong, X. Y., et al. Effect of vegf gene knockdown on growth of the murine sarcoma cell line MS-K. Cells. 16 (6), 625-638 (2011).
- Kidani, T., Yasuda, R., Miyawaki, J., Oshima, Y., Miura, H., Masuno, H. Bisphenol A Inhibits Cell Proliferation and Reduces the Motile Potential of Murine LM8 Osteosarcoma Cells. Anticancer Res. 37 (4), 1711-1722 (2017).
- Sugiyasu, K., et al. Radio-sensitization of the murine osteosarcoma cell line LM8 with parthenolide, a naturalinhibitor of NF-κB. Oncol Lett. 2 (3), 407-412 (2011).
- Daigeler, A., et al. Heterogeneous in vitro effects of doxorubicin on gene expression in primary human liposarcoma cultures. BMC Cancer. 29 (8), 313 (2008).
