Een verbeterde methode voor de verzameling van de cerebrospinale vloeistof van narcose muizen
Summary
Dit protocol beschrijft een verbeterde techniek voor de overvloedige hoeveelheid cerebrospinale vloeistof (CSF) met geen besmetting uit bloed. Met grotere sample collectie en zuiverheid, kunnen meer analyses worden uitgevoerd met behulp van CSF om ons begrip van ziekten die de hersenen en het ruggenmerg beïnvloeden.
Abstract
De cerebrospinale vloeistof (CSF) is een waardevolle lichaamsvloeistof p.a. in onderzoek neurowetenschap. Het is een van de vloeistoffen in de dichtstbijzijnde contact met het centrale zenuwstelsel en zo kan worden gebruikt voor het analyseren van de zieke staat van de hersenen of ruggenmerg zonder direct toegang tot deze weefsels. Echter bij muizen is het moeilijk te verkrijgen van de cisterna magna als gevolg van de nabijheid van bloedvaten, besmetten die vaak monsters. Het gebied voor CSF collectie in muizen is ook moeilijk te ontleden en vaak alleen kleine steekproeven worden verkregen (maximaal 5-7 µL of minder). Dit protocol beschrijft in detail een techniek die verbetert op de huidige methoden van collectie Minimaliseer verontreiniging van bloed te voorzien in de overvloedige collectie van CB (gemiddeld die 10-15 µL kan worden geïnd). Deze techniek kan worden gebruikt met andere methoden van de dissectie voor weefsel collectie van muizen, zoals het geen voor alle weefsels tijdens de CSF extractie gevolgen heeft. Dus, de hersenen en het ruggenmerg ondervinden geen problemen met deze techniek en intact blijven. Met grotere CSF sample collectie en zuiverheid, meer analyses kunnen worden gebruikt met dit onderzoek van de neurowetenschappen vloeistof verder steun en ziekten van de hersenen en het ruggenmerg beter te begrijpen.
Introduction
Het CB is een waardevolle lichaamsvloeistof p.a. in onderzoek neurowetenschap. Het CB bestaat voornamelijk uit bloedplasma, met enkele cellen (geen rode bloedcellen en slechts een paar witte bloedcellen) en is bijna op eiwit-vrij. Het is een van de vloeistoffen in nauw contact met het centrale zenuwstelsel (CNS) en het vele elektrolyten uit vanuit de hersenen en het ruggenmerg aan de perifere systeem kan doorgeven. Bij de mens, CSF monsters kan worden verzameld om te helpen bij de diagnose van de ziekte of voor onderzoeksdoeleinden in klinische proeven, als een spinal tap (of de Lumbaalpunctie) is een kleine, invasieve procedure: de CSF vloeistof kan wijzigingen in het VNV zonder voor directe toegang tot deze weefsels. Dus, in de afgelopen jaren, voor onderzoeksdoeleinden in de kliniek, CSF monsters zijn verkregen van patiënten van neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Alzheimer en andere dementie1,2,3. Er zijn vele biomerker-tests die zijn ontwikkeld met behulp van CSF monsters te kunnen helpen bij de diagnose van de ziekten in de kliniek2,3. Er is echter veel discussie over de betrouwbaarheid van deze tests te produceren consistente, gevoelige resultaten specifiek diagnose ziekte4,5. Dus, is er een grote behoefte aan de ontwikkeling van betere tests en doelstellingen, die kunnen worden gevonden in het CB, steun bij het opstellen van een standaard techniek aan het diagnosticeren van neurodegeneratieve ziekten met grotere gevoeligheid en specificiteit. Vanwege het potentiële belang van menselijke CSF monsters in ziekte is de collectie van CB van knaagdieren in onderzoek neurowetenschap ook van belang.
Muizen zijn belangrijke dieren in biologische en medisch onderzoek en zorgen voor het testen van potentiële therapeutische stoffen en proof-of-concept studies voor menselijke klinische proeven. Bij muizen is het echter moeilijk te verkrijgen van CSF monsters als gevolg van de nabijheid van de hersenen in een klein dier, zoals de gebruikelijke methode van CSF collectie in muizen is te verkrijgen via de cisterna magna, een opening tussen het cerebellum en de dorsale oppervlak van het verlengde merg. Dit veroorzaakt problemen in het verzamelen van CSF monsters zoals dit gebied moeilijk is te ontleden om en in de directe nabijheid van bloedvaten, waardoor het risico van besmetting van bloedcellen. Als gevolg van deze moeilijkheden, de meeste onderzoekers kunnen uitsluitend worden verkregen door een kleine hoeveelheid van CB p.a. (meestal vermeld als 5-7 µL) en de besmetting van CSF monsters door bloedcellen is een primaire zorg voor analyses6,7,8 , 9. bloed besmetting kan obscure resultaten en niet echt overeen met de staat van het centraal zenuwstelsel. Bovendien beperkt monster kan invloed hebben op onderzoek zoals het gebruikelijke bedrag verzameld van muizen voldoende voor slechts één meting (in tweevoud of drievoud is) met behulp van de enzym-verbonden immunosorbent analyse (ELISA). Dus, CSF monsters meestal uit meerdere muizen zijn samengevoegd om genoeg monster meerdere tests uitvoeren. Ontwikkeling van een protocol voor de overvloedige, onbesmette collectie van CB van muizen is zeer gewenst en bij het verbeteren van de neurowetenschappen onderzoek met behulp van knaagdieren gunstig zal zijn.
In dit protocol, een techniek voor het overvloedige (gemiddeld 10-15 µL) collectie van CB van narcose muizen wordt in detail beschreven en verbetert op een op dit moment bekende methode van CSF-collectie om te minimaliseren van verontreiniging van bloed10. Een robuust protocol voor CSF collectie zal helpen in de ontwikkeling van CSF gebaseerde biomerker tests, die kan worden gebruikt om steun in de diagnose van de ziekte, evenals het verbeteren van onderzoek in de mechanismen die ten grondslag liggen aan ziekten van de CNS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol beschrijft in detail een techniek die verbetert op huidige methoden10 van CSF collectie Minimaliseer verontreiniging van bloed te voorzien in de overvloedige collectie van CB (gemiddeld ~ 10-15 µL kan worden verkregen) van muizen. Bij het afbreken van de capillaire tip, de tip van het capillair mag niet te klein (als toen het CB worden uitgepakt heel langzaam) of te groot (zal niet fijn genoeg om te verzamelen van het CB en het weefsel kan worden ingediend in het capillair). Zorg moe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de National Natural Science Foundation of China (81650110527, 81371400) en nationale sleutel Basic Research programma van China (2013CB530900).
Materials
| Chloral hydrate (used as anesthetic) | Sinopharm Chemicals Reagen Co. Ltd. | 30037517 | CAS number 302-17-0. |
| Dissecting scissors | 66 vision technology | 54002 | |
| Dissecting curved forceps | 66 vision technology | 53072 | |
| Dissecting straight forceps | 66 vision technology | 53070 | |
| Mouse adapter (with ear bars) | Made in-house. | N/A | Similar equipment available from World Precision Instruments. |
| Dissecting microscope | Meiji Labax | Model 15381 | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301 | |
| Magnetic base for micromanipulator | Kanetec | MB-K | |
| Glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | Model P-1000 | |
| Syringes (1ml) | Tansoole | 02024692 | For 1ml. |
| Microtubes (1.5ml) | Axygen | MCT-150-C | |
| Protease inhibitor Cocktail Set III EDTA-free | Calbiochem | 539134 | |
| Human Aβ42 ELISA kit | Invitrogen | KHB3441 | |
| Piping (teflon tubing) | World Precision Instruments | MMP-KIT | Obtained from a microinjection kit and attached to the capillary holder and syringe. |
| Mini centrifuge | Tiangen Biotech | OSE-MC8 | |
| Cotton buds | Obtained from any household store/pharmacy. | N/A |
References
- Anoop, A., Singh, P. K., Jacob, R. S., Maji, S. K. CSF Biomarkers for Alzheimer’s Disease Diagnosis. Int. J. Alzheimers. Dis. 2010, 1-12 (2010).
- Blennow, K., Hampel, H., Weiner, M., Zetterberg, H. Cerebrospinal fluid and plasma biomarkers in Alzheimer disease. Nat. Rev. Neurol. 6 (3), 131-144 (2010).
- Schoonenboom, N. S. M., et al. Cerebrospinal fluid markers for differential dementia diagnosis in a large memory clinic cohort. Neurology. 78 (1), 47-54 (2012).
- Molinuevo, J. L., et al. The clinical use of cerebrospinal fluid biomarker testing for Alzheimer’s disease diagnosis: A consensus paper from the Alzheimer’s Biomarkers Standardization Initiative. Alzheimer’s Dement. 10 (6), 808-817 (2014).
- Fagan, A. M. CSF biomarkers of Alzheimer’s disease: impact on disease concept, diagnosis, and clinical trial design. Adv. Geriatr. 2014, 1-14 (2014).
- Ramautar, R., et al. Metabolic profiling of mouse cerebrospinal fluid by sheathless CE-MS. Anal. Bioanal. Chem. 404 (10), 2895-2900 (2012).
- Liu, L., Herukka, S., Minkeviciene, R., Vangreon, T., Tanila, H. Longitudinal observation on CSF Aβ42 levels in young to middle-aged amyloid precursor protein/presenilin-1 doubly transgenic mice. Neurobiol. Dis. 17 (3), 516-523 (2004).
- Schelle, J., et al. Prevention of tau increase in cerebrospinal fluid of APP transgenic mice suggests downstream effect of BACE1 inhibition. Alzheimer’s Dement. , (2016).
- You, J. -. S., Gelfanova, V., Knierman, M. D., Witzmann, F. A., Wang, M., Hale, J. E. The impact of blood contamination on the proteome of cerebrospinal fluid. Proteomics. 5 (1), 290-296 (2005).
- Liu, L., Duff, K. A Technique for Serial Collection of Cerebrospinal Fluid from the Cisterna Magna in Mouse. J. Vis. Exp. (21), (2008).
- Maia, L. F., et al. Changes in amyloid-β and Tau in the cerebrospinal fluid of transgenic mice overexpressing amyloid precursor protein. Sci. Transl. Med. 5 (194), 194re2 (2013).
- Oshio, K. Reduced cerebrospinal fluid production and intracranial pressure in mice lacking choroid plexus water channel Aquaporin-1. FASEB J. , (2004).
