脑切片神经元树突的双光子钙成像

Summary

本文提出了一种将全细胞贴钳记录和双光子成像相结合的方法, 记录急性脑切片神经元树突中的 Ca^{2 +}瞬态。

Abstract

钙 (Ca^{2 +}) 成像是研究神经元树突内胞内 Ca^{2 +}信号的时空动力学的有力工具。Ca^{2 +}的波动可以通过多种膜和胞内机制进行, 并在诱导突触可塑性和调控树突状兴奋性方面起着关键作用。因此, 在树突状分支中记录不同类型的 Ca^{2 +}信号的能力对于研究树突的集成信息的小组很有价值。双光子显微镜的出现使这种研究更容易通过解决活体组织中成像的固有问题, 如光散射和光损伤。此外, 通过将常规的电生理技术与双光子 Ca^{2 +}成像相结合, 可以对神经元树突中的局部 Ca^{2 +}的波动进行并行研究, 并记录突触活动在soma.在这里, 我们描述如何使用此方法来研究 GABAergic 抑制中间神经元树突中局部 Ca² + 瞬态 (猫) 的动力学。该方法还可用于研究急性脑切片中不同神经元类型的树突状 Ca^{2 +}信号。

Introduction

神经元对网络活动的贡献在很大程度上取决于它所接受的突触输入的动态性质。传统上, 神经元突触活动特征的主要方法依赖于通过电刺激通道轴突引起的突触后电流的体细胞全细胞膜片钳记录。但是, 在这种情况下, 只有下部定位突触的活动才会如实地报告为¹。此外, 为了评估突触特定机制, 在特定位置对神经元和树突的记录被用来瞄准感兴趣的突触和树突整合的机制。通过光学和电生理技术的联姻, 在突触生理学领域取得了重大突破。双光子励磁激光扫描显微镜 (2PLSM) 结合 Ca^{2 +}成像和 optogenetic 工具可以揭示在脑切片中特定神经元连接的突触活动动态组织的巨大细节在体外和在体内。

2PLSM 从传统的单光子励磁显微镜中脱颖而出的几个关键优势: (1) 由于双光子激发的非线性性质, 荧光只在焦体积中产生, 所有发射的光子都代表了有用的信号 (不需要针孔);(2) 较长的波长, 用于 2PLSM, 更有效地穿透散射组织;此外, 分散的光子太稀, 无法产生双光子激发和背景荧光;(3) 光损伤和毒性也限于焦平面。因此, 尽管与传统共焦显微镜相比, 2 光子系统的成本很高, 但2PLSM 仍然是高分辨率研究厚活组织神经元结构和功能的一种选择方法。

2PLSM 在散射组织中的第一次应用是对树突状棘的结构和功能的图像³。2PLSM 结合 Ca^{2 +}影像显示, 棘状功能作为隔离的生物化学隔间。由于在许多神经元类型中, 棘和单个突触之间存在一对一的对应关系⁴, 双光子 Ca^{2 +}成像很快成为报告完整组织⁵中单个突触活动的有用工具, ^6,7,8。此外, 2 plsm Ca^{2 +}成像成功地用于监测单钙通道的活动和内在和突触电导之间的非线性相互作用, 以及评估状态和活动依赖性管理 Ca^{2 +}信号在神经元树突^{5,6,7,8,9,10,11}。

钙是一种无处不在的胞内第二信使, 其亚细胞时空组织决定了生理反应的方向, 从突触强度的变化到离子通道、枝晶和脊柱生长的调节, 作为以及细胞死亡和生存。树突状 Ca^{2 +}海拔通过激活多个通路而发生。动作电位 (APs), backpropagating 到树突, 开放电压门控钙通道¹²和产生相对全局 Ca^{2 +}瞬变 (猫) 在树突和刺¹³。突触传输与突触后 Ca 的激活相关联^{2 +}-渗透性受体 (NMDA, Ca^{2 +}渗透 AMPA 和 kainate), 触发突触猫^6,14,15。最后, supralinear Ca^{2 +}事件可在特定条件下的树突中生成^11,12,13,16。

双光子 Ca^{2 +}成像与膜片钳电生理记录结合使用合成 Ca^{2 +}敏感荧光指示器, 通常通过补丁电极在整个细胞记录中传递.用于量化 Ca^{2 +}动态的标准方法基于双指示器方法¹⁷¹⁸。它使用两个具有良好分离发射光谱的显影 (例如), 将红色 ca^{2 +}不敏感染料与绿色 ca^{2 +}指示器 (如俄勒冈州绿色 BAPTA-1 或 Fluo-4) 的组合, 与单指示器方法。首先, ca^{2 +}不敏感的染料用于定位小的兴趣结构 (树突状分支和刺), 其中将执行 ca^{2 +}成像。其次, 绿色和红色荧光 (ΔG) 的变化之间的比值被计算为 [ca^{2 +}] 的度量值, 对于基线荧光的变化, 由于 [ca^{2 +}]₀¹⁷中的波动, 它基本上不敏感。^,18. 此外, 荧光变化可以用绝对 Ca^{2 +}浓度¹⁹来校准。

当运行双光子 Ca^{2 +}成像实验的急性切片是一个普遍关注的是细胞健康和图像获取的稳定性, 由于高激光功率通常使用。此外, 在 ca^{2 +}成像实验中, 由于 ca^{2 +}指示器充当高度移动外源 ca^{2 +}的事实, 对亚细胞 Ca^{2 +}动态的摄动和大量高估感到担忧。缓冲区.因此, Ca^{2 +}指示器的选择及其浓度取决于神经元类型、猫的预期振幅和实验问题。

我们 修改了双光子 Ca^{2 +}成像方法, 以调查 GABAergic 中间神经元9、10、11、20、21的树突中 ca² + 的波动情况.^,22. 虽然早期 Ca^{2 +}成像研究的大部分都是在主神经元中进行的, 但抑制性中间神经元展示了不同于锥体细胞20的功能 Ca² + 机制.^,23,24. 这些 interneuron 特定的机制 (例如、Ca^{2 +}可渗透 AMPA 受体) 可能在调节细胞活动方面发挥特定作用。虽然树突状 Ca^{2 +}信号在中间神经元是一个诱人的目标进一步调查, 双光子 Ca² + 成像在这些细胞的树突提出了额外的挑战, 从更薄的树枝直径和缺乏刺一个特别高的内生 Ca^{2 +}绑定容量。由于我们的研究兴趣集中在研究海马中间神经元, 下面的协议, 虽然适用于不同的神经元群体, 适应于应对这些挑战。

该协议是用商业共焦双光子显微镜执行的, 配备两个外部的非 descanned 探测器 (NDDs)、电光调制器 (EOM) 和 Dodt 扫描梯度对比 (SGC), 并安装在光学表上。显微镜与钛: 蓝宝石多光子激光模式锁定在 800 nm (> 3 W, 140 fs 脉冲, 80 赫兹重复率)。该成像系统配备了一个标准的电生理平台, 包括一个温度控制的灌注室, 一个两个并联的翻译平台, 一个电脑控制的微电极放大器, 数字化仪, 刺激单元和数据采集软件。

Protocol

所有的实验都是按照大学的动物保护委员会和加拿大动物保育理事会的动物福利准则进行的。 1. 初步准备 (可选: 提前1天准备) 准备三种类型的人工脑脊液 (ACSF) 溶液 (正常, 蔗糖和恢复解决方案, 1 升每一个; 请参见表 1)。调整溶液的渗透到 300 10 mOsm25和冷却 ACSF 蔗糖下降到一个接近冰点 (0-4 °c)。注: 使用低钠切削液 (ACSF 蔗糖) 有助于保?…

Representative Results

利用本文提出的协议, 我们获得了由体细胞电流注入诱发的猫, 并通过电刺激在海马 CA1 区 oriens/alveus 中间神经元树突。在对神经元进行修补后, 根据其形状和位置进行识别, 我们在给定距离的 linescans 上的多点处获得了一个近端枝晶 (图 1A)。我们观察到 backpropagating APs 引起的猫的振幅减少, 因为躯体的距离增加 (指示 AP 振幅减少或钙通道分布的距离依?…

Discussion

此处所示的方法演示了如何将双光子 Ca^{2 +}成像和补丁钳电生理学结合在一起, 研究急性脑切片神经元树突状的树形 ca^{2 +}信号。此方法允许对由电刺激或 backpropagating AP 在树突状段诱发的局部 Ca^{2 +}海拔和细胞的躯体反应进行监测。这使得它成为研究树突树各部分如何集成输入和与体细胞通信的绝佳工具。但是, 考虑到实验的长度, 必须特别注意细胞的健康, 限制使用激光功率进…

Materials

Animal Strain: Mouse CD1	Charles River	022
Isoflurane	AbbVie Corporation	0B506-099
CGP 55845 hydrochloride	Abcam	ab120337
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C4901
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M8266
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	230391
Paraformaldehyde powder, 95%	Sigma-Aldrich	158127
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P3911
Potassium gluconate	Sigma-Aldrich	P1847
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S8875
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S5886
Sucrose	Sigma-Aldrich	S9378
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
Trizma base	Sigma-Aldrich	T1503
Trizma hydrochloride	Sigma-Aldrich	T3253
Sodium phosphate dibasic dihydrate	Sigma-Aldrich	71643
Sodium phosphate monobasic monohydrate	Sigma-Aldrich	S9638
Biocytin	Sigma-Aldrich	B4261
Alexa Fluor 594 Hydrazide	ThermoFisher Scientific	A10438
SR95531 (Gabazine)	Abcam	ab120042
Adenosine triphosphate (ATP)-Tris	Sigma-Aldrich	A9062
Guanosine (GTP)-Na+	Sigma-Aldrich	G8877
Oregon Green BAPTA-1	ThermoFisher Scientific	O6812
Phosphocreatine di(tris) salt	Sigma-Aldrich	P1937
Streptavidin-conjugated Alexa-546	ThermoFisher Scientific	S11225
Patch Borosilicate Glass Capillaries	World Precision Instruments	1B100F-4
Theta Borosilicate Glass Capillaries	Sutter Instrument	BT-150-10
P-97 Flaming/Brown Micropipette puller	Sutter Instrument
TCS SP5 Confocal Multiphoton Microscope	Leica Microsystems
Chameleon Ultra II Ti:Sapphire multiphoton laser	Coherent
LAS AF Imaging Acquisition Software	Leica Microsystems
Temperature Controller TC-324B	Warner Instruments
MultiClamp 700B Amplifier	Molecular Devices
Digidata 1440A Digitizer	Molecular Devices
Confocal Translator	Siskiyou
Micromanipulator	Siskiyou
pClamp Data Acquisition Software	Molecular Devices
A365 Constant Current Stimulus Isolator	World Precision Instruments
Vibraplane Optical Table	Kinetic Systems