To-foton Calcium Imaging i Neuronal dendritter i hjernen skiver

Summary

Vi præsenterer en metode, der kombinerer hele-celle patch-klemme optagelser og to-foton imaging for at registrere Ca^{2 +} transienter i neuronal dendritter i akut hjernen skiver.

Abstract

Calcium (Ca^{2 +}) imaging er et kraftfuldt værktøj til at undersøge spatiotemporelle dynamikken i intracellulære Ca^{2 +} signaler i neuronal dendritter. Ca^{2 +} udsving kan opstå gennem en række membran og intracellulære mekanismer og spiller en afgørende rolle i induktion af synaptisk plasticitet og regulering af dendritiske ophidselse. Derfor, evnen til at registrere forskellige typer af Ca^{2 +} signaler i dendritiske grene er værdifulde for grupper at studere, hvordan dendritter integrere oplysninger. Fremkomsten af to-foton mikroskopi har foretaget sådanne undersøgelser betydeligt lettere ved at løse problemerne forbundet med billedbehandling i levende væv, såsom lysspredning og solskader. Derudover gennem kombinationen af konventionelle elektrofysiologiske teknikker med to-foton Ca^{2 +} imaging, er det muligt at undersøge lokale Ca^{2 +} udsving i neuronal dendritter parallelt med optagelser af synaptic aktivitet i Soma. Vi beskriver her, hvordan du bruger denne metode til at studere dynamikken i lokale Ca^{2 +} transienter (katte) i dendritter af GABAergic hæmmende interneurons. Metoden kan også anvendes til at studere dendritiske Ca^{2 +} signalering i forskellige neuronal typer i akut hjernen skiver.

Introduction

Bidrag af en neuron netværk aktivitet er i vid udstrækning bestemt af den dynamiske natur af synaptic indgange det modtager. Traditionelt har påberåbt den fremherskende metode til kendetegner synaptic aktivitet i neuroner somatiske hele-celle patch-clamp optagelser af postsynaptiske strømninger fremkaldt af elektrisk stimulation af axoner af passage. Dog er kun aktiviteten af proksimalt beliggende synapser sandfærdigt rapporteret i denne sag¹. Derudover for at vurdere synapse-specifikke mekanismer, har optagelser fra par af neuroner og fra dendritter på en bestemt placering været anvendt til at målrette synapser af interesse og mekanismer for dendritiske integration, henholdsvis. Et stort gennembrud inden for synaptic fysiologi blev opnået gennem et ægteskab af optiske og elektrofysiologiske teknikker. To-foton excitation laser scanning mikroskopi (2PLSM) i kombination med Ca^{2 +} imaging og optogenetic værktøjer kan afsløre enorme detaljer af den dynamisk organisation af synaptic aktivitet på bestemte neuronal forbindelser i hjerne skiver i vitro og i vivo.

Flere vigtige fordele lavet 2PLSM skiller sig ud fra de konventionelle, one-foton excitation mikroskopi²: (1) som følge af en ikke-lineære karakter af to-foton excitation, fluorescens genereres kun i den fokale volumen, og alle udsendte fotoner repræsenterer nyttige signaler (ikke behov for pinhole); (2) længere bølgelængder, bruges i 2PLSM, trænge spredning væv mere effektivt; Derudover er spredte fotoner også fortyndes til at producere to-foton excitation og baggrunden fluorescens; (3) solskader og fototoksicitet er også begrænset til brændplanet. Derfor, trods den høje pris på 2-foton systemer i forhold til konventionelle Konfokal mikroskoper, 2PLSM stadig en metode til høj opløsning undersøgelse af neuronal struktur og funktion i tyk levende væv.

Den første anvendelse af 2PLSM i spredning væv var. struktur og funktion af dendritiske pigge³billedet 2PLSM i kombination med Ca^{2 +} imaging har afsløret at pigge fungerer som isolerede biokemiske rum. Da der er en en til en-korrespondance mellem pigge og individuelle synapser⁴i mange neuronal typer blev to-foton Ca^{2 +} imaging snart en nyttig værktøj rapportering aktivitet af individuelle synapser i intakt væv^{5, 6,7,8}. Desuden blev 2PLSM-baserede Ca^{2 +} imaging med succes brugt til at overvåge aktiviteten på enkelt calcium kanaler og ikke-lineære samspillet mellem de iboende og synaptic conductances, samt at vurdere stat – og aktivitet-afhængige regulering af Ca^{2 +} signalering i neuronal dendritter^{5,6,7,8,9,10,11}.

Calcium er en allestedsnærværende intracellulære anden budbringer, og dens subcellulært spatiotemporelle organisation bestemmer retningen af fysiologiske reaktioner fra ændringer i synaptisk styrke på reguleringen af ion-kanaler, dendrit og rygsøjlen vækst, som samt celledød og overlevelse. Dendritiske Ca^{2 +} stigninger opstår via aktivering af flere veje. Handling potentialer (APs), backpropagating til dendritter, åbne spænding-gated calcium kanaler¹² og producerer relativt globale Ca^{2 +} transienter (katte) i dendritter og pigge¹³. Synaptisk transmission er forbundet med aktivering af postsynaptiske Ca^{2 +}-gennemtrængelige receptorer (NMDA, Ca^{2 +}-gennemtrængelige AMPA og kainate), udløse synaptic katte^6,14,15. Endelig kan supralinear Ca^{2 +} begivenheder genereres i dendritter under visse betingelser^11,12,13,16.

To-foton Ca^{2 +} imaging i kombination med patch-clamp elektrofysiologiske optagelser beskæftiger syntetiske Ca^{2 +}-følsomme fluorescerende indikatorer, der typisk leveres gennem patch elektrode under hele-celle optagelser . En standard metode til kvantificering af Ca^{2 +} dynamics er baseret på dual indikator metode^17,18. Det bruger to fluorophores med godt adskilt emission spektre (f.eks, en kombination af en rød Ca^{2 +}-ufølsom farvestof med grønne Ca^{2 +} indikatorer, såsom Oregon Green BAPTA-1 eller Fluo-4) og har flere fordele sammenlignet med den enkelt indikator metode. Første, en Ca^{2 +}-ufølsom farvestof bruges til at finde små strukturer af interesse (dendritiske grene og pigge) hvor Ca^{2 +} billedbehandling vil blive udført. For det andet beregnes forholdet mellem ændringen i grønne og røde fluorescens (ΔG/R) som en foranstaltning af [Ca^{2 +}], som er i vid udstrækning ufølsom over for ændringer i baseline fluorescens på grund af udsving i [Ca^{2 +}]₀^{17 , 18}. Endvidere fluorescens ændringer kan kalibreres med hensyn til absolutte Ca^{2 +} koncentrationer¹⁹.

En generel bekymring, når du kører to-foton Ca^{2 +} imaging eksperimenter i akut skiver er celle sundhed og stabilitet af image erhvervelse på grund af den høje laser power typisk bruges. Derudover i Ca^{2 +} imaging eksperimenter er der bekymring om undertrykkelse af netbårne og betydelig overvurdering af subcellulært Ca^{2 +} dynamics at Ca^{2 +} indikatorer fungere som meget mobile eksogene Ca^{2 +} buffere. Således valget af Ca^{2 +} indikator og dets koncentration afhænger af typen neuronal, den forventede amplitude af katte, og den eksperimentelle spørgsmål.

Vi tilpasset to-foton Ca^{2 +} billedbehandling metode til undersøgelse af Ca^{2 +} udsving i dendritter GABAergic interneurons^{9,10,11,20,21 , 22}. mens hovedparten af tidlige Ca^{2 +} billeddiagnostiske undersøgelser blev udført i vigtigste neuroner, hæmmende interneurons fremvise en lang række funktionelle Ca^{2 +} mekanismer, der adskiller sig fra dem i pyramideformet celler^{20 , 23 , 24}. disse interneuron-specifikke mekanismer (fx, Ca^{2 +} gennemtrængelig AMPA-receptorer) kan spille bestemte roller i regulerer celleaktivitet. Mens dendritiske Ca^{2 +} signalering i interneurons er et fristende mål for yderligere undersøgelse, giver to-foton Ca^{2 +} imaging i dendritter af disse celler yderligere udfordringer, fra en tyndere diameter af dendritter og mangel på pigge til en særlig høj endogene Ca^{2 +} bindende kapacitet. Som vores forskningsinteresser fokuserer på studiet af hippocampus interneurons, blev følgende protokol, mens gælder for forskellige neuronal populationer, tilpasset til at håndtere disse udfordringer.

Denne protokol blev udført med en kommerciel Konfokal to-foton mikroskop, som var udstyret med to eksterne, ikke-descanned detektorer (NDDs), elektro-optiske modulator (EOM) og et Dodt scanning gradient kontrast (SGC), og installeret på en optisk tabel. Mikroskopet blev kombineret med en Ti:Sapphire multiphoton laser mode-låst på 800 nm (> 3 W, 140 fs pulser, 80 Hz gentagelseshyppighed). Den imaging system var udstyret med en standard Elektrofysiologi rig, herunder en perfusion kammer med temperaturkontrol, en oversætte platform med to micromanipulators, en computer-styrede mikroelektrode forstærker, en digitizer, en stimulation enheden, og data erhvervelse software.

Protocol

Alle eksperimenter blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne dyrevelfærd dyr beskyttelse Udvalget af Université Laval og den canadiske Rådet på Animal Care. 1. indledende forberedelse (valgfri: forberede 1 dag i forvejen) Forberede tre typer af kunstige cerebrospinalvæske (ACSF) løsning (Normal, saccharose og Recovery-løsninger, 1 L hver, se tabel 1). Justere osmolalitet af løsninger til 300 ± 10 mOsm25 og cool ACSF-sacchar…

Representative Results

Ved hjælp af protokollen præsenteres her, opnåede vi katte fremkaldt af somatiske nuværende injektion og elektrisk stimulation i dendritter af oriens/alveus interneurons i området CA1 hippocampus. Efter lappe en neuron, identificeret baseret på dens form og stilling, vi overtog linescans på tværs af en proksimal dendrit på flere punkter på givet afstande fra soma (figur 1A). Vi observeret et fald i amplitude af katte induceret af backpropagating APs…

Discussion

Metoden vist her demonstrerer, hvordan kombinationen af to-foton Ca^{2 +} imaging og patch-clamp Elektrofysiologi kan bruges til at studere dendritiske Ca^{2 +} signalering i neuronal dendritter i akut hjernen skiver. Denne metode giver mulighed for overvågning af både de lokale Ca^{2 +} stigninger fremkaldt af elektrisk stimulation eller backpropagating AP i dendritiske segmenter, og cellens somatiske svar. Dette gør det et fremragende værktøj til at undersøge hvordan forskellige dele af tr…

Materials

Animal Strain: Mouse CD1	Charles River	022
Isoflurane	AbbVie Corporation	0B506-099
CGP 55845 hydrochloride	Abcam	ab120337
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C4901
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M8266
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	230391
Paraformaldehyde powder, 95%	Sigma-Aldrich	158127
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P3911
Potassium gluconate	Sigma-Aldrich	P1847
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S8875
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S5886
Sucrose	Sigma-Aldrich	S9378
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
Trizma base	Sigma-Aldrich	T1503
Trizma hydrochloride	Sigma-Aldrich	T3253
Sodium phosphate dibasic dihydrate	Sigma-Aldrich	71643
Sodium phosphate monobasic monohydrate	Sigma-Aldrich	S9638
Biocytin	Sigma-Aldrich	B4261
Alexa Fluor 594 Hydrazide	ThermoFisher Scientific	A10438
SR95531 (Gabazine)	Abcam	ab120042
Adenosine triphosphate (ATP)-Tris	Sigma-Aldrich	A9062
Guanosine (GTP)-Na+	Sigma-Aldrich	G8877
Oregon Green BAPTA-1	ThermoFisher Scientific	O6812
Phosphocreatine di(tris) salt	Sigma-Aldrich	P1937
Streptavidin-conjugated Alexa-546	ThermoFisher Scientific	S11225
Patch Borosilicate Glass Capillaries	World Precision Instruments	1B100F-4
Theta Borosilicate Glass Capillaries	Sutter Instrument	BT-150-10
P-97 Flaming/Brown Micropipette puller	Sutter Instrument
TCS SP5 Confocal Multiphoton Microscope	Leica Microsystems
Chameleon Ultra II Ti:Sapphire multiphoton laser	Coherent
LAS AF Imaging Acquisition Software	Leica Microsystems
Temperature Controller TC-324B	Warner Instruments
MultiClamp 700B Amplifier	Molecular Devices
Digidata 1440A Digitizer	Molecular Devices
Confocal Translator	Siskiyou
Micromanipulator	Siskiyou
pClamp Data Acquisition Software	Molecular Devices
A365 Constant Current Stimulus Isolator	World Precision Instruments
Vibraplane Optical Table	Kinetic Systems