Imaging del due-fotone calcio nei dendriti neuronali nelle fette del cervello

Summary

Presentiamo un metodo che unisce le registrazioni della intero-cellula patch-clamp e due-fotone imaging per registrare transitori di Ca^{2 +} nei dendriti neuronali nelle fette del cervello acuto.

Abstract

La formazione immagine del calcio (Ca^{2 +}) è un potente strumento per studiare la dinamica spazio-temporale di Ca^{2 +} segnali intracellulari nei dendriti neuronali. CA^{2 +} fluttuazioni possono verificarsi attraverso una varietà di meccanismi intracellulari e di membrana e svolgono un ruolo cruciale nell’induzione di plasticità sinaptica e nella regolazione dell’eccitabilità dendritiche. Quindi, la possibilità di registrare diversi tipi di Ca^{2 +} segnali in rami dentritici è preziosa per gruppi studiano come dendriti integrano informazioni. L’avvento della microscopia del due-fotone ha reso tali studi significativamente più facile risolvendo i problemi inerenti all’imaging in tessuto vivo, come ad esempio la dispersione della luce e photodamage. Inoltre, attraverso la combinazione di tecniche elettrofisiologiche convenzionale con due fotoni Ca^{2 +} imaging, è possibile indagare locale Ca^{2 +} le fluttuazioni nei dendriti neuronali in parallelo con le registrazioni di attività sinaptica Soma. Qui, descriviamo come utilizzare questo metodo per studiare la dinamica locale Ca^{2 +} transitori (gatti) nei dendriti di interneuroni inibitori GABAergici. Il metodo può essere applicato anche allo studio dendritiche Ca^{2 +} segnalazione in diversi tipi di un neurone in fettine di cervello acuto.

Introduction

Il contributo di un neurone per attività di rete è in gran parte determinato dalla natura dinamica degli ingressi sinaptici che riceve. Tradizionalmente, il metodo predominante di caratterizzare l’attività sinaptica nei neuroni è invocata da registrazioni di intero-cellula somatica patch clamp di correnti postsinaptiche evocate da stimolazione elettrica degli assoni di passaggio. Tuttavia, unica attività delle sinapsi prossimalmente trova veritiero è segnalato in questo caso¹. Inoltre, per valutare i meccanismi specifici di sinapsi, registrazioni da coppie di neuroni e da dendriti in una posizione specifica sono state utilizzate per indirizzare le sinapsi di interesse e i meccanismi di integrazione dendritiche, rispettivamente. Un importante passo avanti nel campo della fisiologia sinaptica è stato realizzato attraverso un connubio di tecniche ottiche ed elettrofisiologiche. Microscopia (2PLSM) in combinazione con Ca^{2 +} imaging e optogenetica strumenti a scansione laser di eccitazione del due-fotone può rivelare dettagli tremende dell’organizzazione dinamica dell’attività sinaptica alle connessioni neuronali specifiche nelle fette del cervello in vitro ed in vivo.

Parecchi vantaggi chiave ha reso 2PLSM risaltare dalla microscopia convenzionale, uno-fotone eccitazione²: (1) a causa di una natura non lineare del due-fotone eccitazione, la fluorescenza viene generata solo nel volume focale, e rappresentano tutti i fotoni emessi segnali utili (senza bisogno di foro di spillo); (2) lunghezze d’onda, utilizzato in 2PLSM, penetra il tessuto di dispersione in modo più efficiente; Inoltre, sparsi i fotoni sono troppo diluiti per produrre eccitazione del due-fotone e fluorescenza di fondo; (3) photodamage e fototossicità sono limitate al piano focale. Di conseguenza, nonostante l’alto costo dei sistemi di 2 fotoni rispetto ai convenzionali microscopi confocali, il 2PLSM rimane un metodo di scelta per le indagini ad alta risoluzione della struttura neuronale e funzione nel tessuto vivente spessa.

La prima applicazione del 2PLSM nel tessuto di scattering è stato all’immagine della struttura e la funzione delle spine dendritiche³. 2PLSM in combinazione con Ca^{2 +} formazione immagine ha rivelato tale funzione di spine come compartimenti biochimici isolati. Poiché in molti tipi di un neurone c’è una corrispondenza univoca tra spine e singole sinapsi⁴, due-fotone Ca^{2 +} imaging presto divenne un utile strumento di reporting dell’attività delle singole sinapsi in tessuto intatto^{5, 6,7,8}. Inoltre, 2PLSM-Ca^{2 +} l’imaging basato su è stato usato con successo per monitorare l’attività dei canali del calcio singolo e le interazioni non lineari tra le conduttanze intrinseche e sinaptiche, nonché di valutare lo stato – e attività-dipendente regolamento del Ca^{2 +} segnalazione nei dendriti neuronali^{5,6,7,8,9,10,11}.

Il calcio è un secondo messaggero intracellulare onnipresente, e relativa organizzazione subcellulare spatiotemporal determina la direzione di reazioni fisiologiche, da cambiamenti nella forza sinaptica del regolamento dello ione di canali, crescita dendrite e della colonna vertebrale, come così come la morte delle cellule e la sopravvivenza. Dendritiche Ca^{2 +} quote altimetriche si verificano attraverso l’attivazione di vie multiple. Potenziali di azione (APs), backpropagating per i dendrites, aperto tensione-gated del calcio canali¹² e produrre relativamente global Ca^{2 +} transitori (gatti) in dendriti e spine¹³. Trasmissione sinaptica è associata con l’attivazione di postsinaptica Ca^{2 +}-permeabili recettori (NMDA, Ca^{2 +}-permeabile AMPA e kainato), attivazione sinaptica gatti^6,14,15. Infine, gli eventi possono Ca^{2 +} possono essere generati nei dendriti sotto determinate circostanze^11,12,13,16.

Si avvale di due fotoni Ca^{2 +} imaging in combinazione con le registrazioni elettrofisiologiche patch clamp sintetico Ca^{2 +}-sensibili indicatori fluorescenti, che in genere sono trasportati attraverso l’elettrodo di patch durante le registrazioni della intero-cellula . Un metodo standard per la quantificazione delle dinamiche^{2 +} Ca è basato sul doppio indicatore metodo^17,18. Utilizza due fluorofori con spettri di emissione ben separati (ad esempio, una combinazione di un rosso Ca^{2 +}-insensibile tintura verde Ca^{2 +} indicatori, quali Oregon Green BAPTA-1 o Fluo-4) e ha diversi vantaggi rispetto alla Metodo unico indicatore. Prima di tutto, a Ca^{2 +}-insensibile colorante viene utilizzato per individuare piccole strutture di interesse (rami dentritici e spine) dove verrà eseguita Ca^{2 +} formazione immagine. In secondo luogo, il rapporto tra la variazione di fluorescenza verde e rosso (ΔG/R) viene calcolato come una misura di [Ca^{2 +}], che è in gran parte insensibile ai cambiamenti di fluorescenza della linea di base a causa di fluttuazioni [Ca^{2 +}]₀^{17 , 18}. Inoltre, i cambiamenti di fluorescenza possono essere calibrati in termini assoluti Ca^{2 +} concentrazioni¹⁹.

Una preoccupazione generale durante l’esecuzione di due fotoni Ca^{2 +} imaging esperimenti in fettine acute è la salute delle cellule e la stabilità dell’acquisizione immagine a causa della laser ad alta potenza in genere utilizzata. Inoltre, in esperimenti di Ca^{2 +} imaging, c’è preoccupazione per la perturbazione e sostanza sovrastima del servizio subcellulare^{2 +} dinamiche per Ca dovuta al fatto che fungono da indicatori di Ca^{2 +} altamente mobile esogeno Ca^{2 +} buffer. Così, la scelta dell’indicatore di Ca^{2 +} e la sua concentrazione dipende il tipo di un neurone, l’ampiezza prevista dei gatti e la questione sperimentale.

Abbiamo adattato il metodo di due fotoni Ca^{2 +} imaging per indagine di Ca^{2 +} fluttuazioni nei dendriti dei neuroni GABAergici interneuroni^{9,10,11,20,21 , 22}. mentre la maggior parte del Ca^{2 +} imaging gli studi iniziali sono stati fatti nei neuroni principali, interneuroni inibitori mostrare una varietà grande di Ca^{2 +} meccanismi funzionali che sono distinti da quelli a cellule piramidali^{20 , 23 , 24}. questi meccanismi di Interneurone specifici (ad es., Ca^{2 +} permeabili i recettori AMPA) possono svolgere ruoli specifici nel regolare l’attività delle cellule. Mentre dendritiche Ca^{2 +} segnalazione in interneuroni è un obiettivo allettante per ulteriori indagini, due-fotone Ca^{2 +} imaging nei dendriti di queste cellule presenta sfide aggiuntive, da un diametro più sottile dei dendriti e la mancanza di spine per una particolarmente elevato Ca^{2 +} associazione capacità endogena. Come la nostra ricerca interessi riguardano lo studio di interneuroni hippocampal, il seguente protocollo, mentre applicabili a differenti popolazioni neuronali, è stato adattato per affrontare queste sfide.

Questo protocollo è stato eseguito con un microscopio a due fotoni confocale commerciale, che era dotato di due rivelatori esterni, non descanned (NDDs), modulatore elettro-ottico (EOM) e un Dodt scansione contrasto sfumatura (SGC) e installato su un tavolo ottico. Il microscopio è stato accoppiato con un laser di multiphoton costituita mode-locking a 800 nm (> 3 W, 140 fs legumi, tasso di ripetizione di 80 Hz). Il sistema di imaging è stato dotato di un impianto di perforazione di elettrofisiologia standard, tra cui una camera di aspersione con controllo della temperatura, una piattaforma di traduzione con due micromanipolatori, un amplificatore microelettrodo computerizzato, un digitalizzatore, una stimolazione unità e software di acquisizione dati.

Protocol

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti conformemente agli orientamenti del Comitato di protezione animale Université Laval e del Consiglio canadese su Animal Care sul benessere degli animali. 1. preparazione preliminare (opzionale: preparare 1 giorno in anticipo) Preparare tre tipi di liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) soluzione (normale, saccarosio e soluzioni di recupero, 1L; si veda tabella 1). Regolare l’osmolalità delle soluzioni a 300 ± 10 mOsm<sup…

Representative Results

Utilizzando il protocollo presentato qui, abbiamo ottenuto gatti evocati mediante iniezione di corrente somatica e da stimolazione elettrica nei dendriti di oriens/alveus interneuroni nella zona CA1 dell’ippocampo. Dopo la patch di un neurone, identificato basata sulla sua forma e la posizione, abbiamo acquisito scansioni attraverso un dendrite prossimale in più punti al dato Distanze dal soma (Figura 1A). Abbiamo osservato una diminuzione dell’ampiezza dei …

Discussion

Il metodo illustrato di seguito viene illustrato l’utilizzo della combinazione del due-fotone Ca^{2 +} imaging ed elettrofisiologia di patch-clamp per lo studio dendritiche Ca^{2 +} segnalazione nei dendriti neuronali nelle fette del cervello acuto. Questo metodo consente per il monitoraggio di entrambi i locali Ca^{2 +} prospetti evocati da AP elettrici di stimolazione o backpropagating in segmenti dendritiche e risposta somatica della cella. Questo lo rende un ottimo strumento per studiare come …

Materials

Animal Strain: Mouse CD1	Charles River	022
Isoflurane	AbbVie Corporation	0B506-099
CGP 55845 hydrochloride	Abcam	ab120337
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C4901
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M8266
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	230391
Paraformaldehyde powder, 95%	Sigma-Aldrich	158127
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P3911
Potassium gluconate	Sigma-Aldrich	P1847
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S8875
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S5886
Sucrose	Sigma-Aldrich	S9378
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
Trizma base	Sigma-Aldrich	T1503
Trizma hydrochloride	Sigma-Aldrich	T3253
Sodium phosphate dibasic dihydrate	Sigma-Aldrich	71643
Sodium phosphate monobasic monohydrate	Sigma-Aldrich	S9638
Biocytin	Sigma-Aldrich	B4261
Alexa Fluor 594 Hydrazide	ThermoFisher Scientific	A10438
SR95531 (Gabazine)	Abcam	ab120042
Adenosine triphosphate (ATP)-Tris	Sigma-Aldrich	A9062
Guanosine (GTP)-Na+	Sigma-Aldrich	G8877
Oregon Green BAPTA-1	ThermoFisher Scientific	O6812
Phosphocreatine di(tris) salt	Sigma-Aldrich	P1937
Streptavidin-conjugated Alexa-546	ThermoFisher Scientific	S11225
Patch Borosilicate Glass Capillaries	World Precision Instruments	1B100F-4
Theta Borosilicate Glass Capillaries	Sutter Instrument	BT-150-10
P-97 Flaming/Brown Micropipette puller	Sutter Instrument
TCS SP5 Confocal Multiphoton Microscope	Leica Microsystems
Chameleon Ultra II Ti:Sapphire multiphoton laser	Coherent
LAS AF Imaging Acquisition Software	Leica Microsystems
Temperature Controller TC-324B	Warner Instruments
MultiClamp 700B Amplifier	Molecular Devices
Digidata 1440A Digitizer	Molecular Devices
Confocal Translator	Siskiyou
Micromanipulator	Siskiyou
pClamp Data Acquisition Software	Molecular Devices
A365 Constant Current Stimulus Isolator	World Precision Instruments
Vibraplane Optical Table	Kinetic Systems