Preparazione ottimale di formalina riparata campioni per Peptide basati su matrice assistita spettrometria totale di desorbimento/ionizzazione Laser i flussi di lavoro di Imaging
Summary
Questo protocollo descrive un metodo attendibile e riproducibile per la preparazione di base di sublimazione di formalina riparata tessuto destinato per imaging spettrometria di massa.
Abstract
L’uso di desorbimento/ionizzazione laser assistito da matrice, spettrometria di massa (MALDI MSI) di imaging ha rapidamente ampliato, poiché questa tecnica analizza una serie di biomolecole da farmaci e lipidi per N-glicani. Anche se esistono varie tecniche di preparazione del campione, rilevare peptidi da formaldeide conservato tessuti rimane una delle sfide più difficili per questo tipo di analisi spettrometria totale. Per questo motivo, abbiamo creato e ottimizzato una solida metodologia che conserva le informazioni spaziali contenute all’interno del campione, mentre suscitando il maggior numero di peptidi ionizzabili. Abbiamo anche l’obiettivo di raggiungere questo obiettivo in modo semplice e conveniente, eliminando potenziali bias o preparazione errore, che può verificarsi quando si usa automatizzata strumentazione. Il risultato finale è un protocollo riproducibile e poco costoso.
Introduction
Spettrometria di massa desorbimento/ionizzazione laser assistito da matrice (MALDI MSI) di imaging è stata impiegata come tecnica di immagine basata per due decenni1,2, analizzando una gamma di biomolecole compreso: lipidi3, peptidi2 ,4, proteine2,5, metaboliti6,7, N-glicani8e molecole sintetiche quali farmaci terapeutici9,10. Il numero di pubblicazioni che dimostrano l’utilità di questa tecnica è cresciuti significativamente sopra l’ultimo decennio6,11,12,13. Alcune molecole, quali i lipidi, sono relativamente facili da analizzare tramite MALDI MSI, in quanto ionizzare prontamente a causa della loro natura chimica e pertanto richiedono poca preparazione preliminare3. Tuttavia, per le destinazioni più difficili come i peptidi, i passaggi necessari a ionizzare efficacemente queste molecole sono ampie e generalmente complicati14. Ci sono attualmente molto poche pubblicazioni che mirano a indirizzo o dimostrano la riproducibilità delle metodologie impiegate per preparare il tessuto per questa tecnica visiva unica15. Per questo motivo, abbiamo compilato le osservazioni e implementate ottimizzazioni in un unico, facile da implementare, metodologia che non dovrebbe richiedono poca o nessuna modificazione, per l’analisi dei peptidi da un formaldeide reticolato tessuto fonte14.
In questo manoscritto, abbiamo descritto una metodologia riproducibile validata, a basso costo per la rilevazione e la mappatura territoriale dei peptidi, generati da formalina congelati (FFF) e fissati in formalina di sezioni di tessuto paraffina (FFPE). Questa metodologia non richiede o si basano su qualsiasi strumentazione specializzata3. In particolare, ci rivolgiamo i molteplici aspetti della preparazione del campione specializzato necessario analizzare peptidi; a pochi passi come antigene recupero16 e rivestimento di matrice. Il nostro protocollo utilizza anche poco costoso attrezzature e reagenti, rendendoli accessibili a una comunità più ampia che altrimenti sarebbero in grado di permettersi l’ apparato robotico alternativo17questa metodologia.
Il ragionamento dietro lo sviluppo di un metodo di preparazione manuale del campione era duplice: in primo luogo, l’uso di un sublimator crea un rivestimento omogeneo e coerenza di cristalli di matrice che sono ~ 1 µm in lunghezza18, qualcosa irraggiungibile con la spruzzatura più comuni tecniche. In secondo luogo, il relativamente piccolo set up costi: il costo totale dell’apparato personalizzato era <$ 1500 dollari australiani. Notiamo che, in termini di costo-efficacia, prezzo per esempio è molto più economico quando non c'è nessun macchinario robotico coinvolti. L'uso di sublimazione è stata segnalata precedentemente, tuttavia, al meglio della nostra conoscenza, metodologie dettagliate che descrivono questo processo e preparazione dei campioni non sono stati segnalati né descritti nella letteratura.
Questo protocollo è destinato per aiutare i ricercatori che hanno accesso a uno spettrometro di massa MALDI e che sono intenti a generare informazioni spaziali in relazione a una bio-molecola di interesse19. In sostanza, MALDI MSI è una forma di istologico di screening che non si basa sugli anticorpi o macchie2.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo è stato progettato per massimizzare la generazione di specie molecolari ionizzabili, eliminando la delocalizzazione degli analiti. I fattori chiave comportano utilizzando lo stesso principio prevalente quando l’applicazione di matrix, digerendo il campione, o ricristallizzazione dopo sublimazione24; vale a dire, che un’anche deposizione di vapore, di matrice o in caso contrario, deve essere creato e mantenuto. Pipettaggio solvente lavaggi per ricristallizzazione e la digestione,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desidera ringraziare il Sydney Medical School Foundation e il Blues e la Fondazione per il finanziamento di parte di questo lavoro attraverso il loro programma di borsa di studio di dottorato per la ricerca sulla malattia di Alzheimer e una sovvenzione di ARC Discovery (DP160102063) assegnato a PKW.
Materials
| Cryo Microtome | Leica | CM3050 | For preparation and section of tissue. |
| Indium Tin Oxide Microscope slides | Bruker | 8237001 | For preparation and section of tissue. |
| Coplin Jars | Sigma Aldrich | S5516 | For preparation and section of tissue. |
| Pressure Cooker | Kambrook | KPR620BSS | For preparation and section of tissue. |
| Sublimator | Chem Glass | NA | For sublimation procedure. Similar in design to the CG-3038 however it was custom made |
| Sand bath | NA | NA | For sublimation procedure. Fine grade river sand held in folded aluminium foil sourced from outside not from any specific company |
| Glass Petri Dish | Sigma Aldrich | CLS70165100 | For sublimation procedure. |
| Vacuum Pump | NA | NA | For sublimation procedure. Sourced as a spare part from an old mass spectrometer |
| Cold trap | Chem Glass | CG-4510-02 | For sublimation procedure. |
| Hot Plate | John Morris | EW-15956-32. | For sublimation procedure. |
| Plastic petri dish | Sigma Aldrich | Z717223 | For sublimation procedure. |
| 37 °C incubator | NA | NA | For sublimation procedure. Not applicable, incubator is non sterile and over 30 years old |
| Blotting paper | Sigma Aldrich | P7796 | For sublimation procedure. |
| Nitrocellulose | Sigma Aldrich | N8395 | For washing of slides. |
| Acetone | Sigma Aldrich | 650501 | For washing of slides. |
| Xylene | Sigma Aldrich | 214736 | For washing of slides. |
| 100% EtOH | Sigma Aldrich | 1.02428 | For washing of slides. |
| 70% EtOH | Sigma Aldrich | NA | For washing of slides. Made in lab from 95% stock ethanol |
| Chloroform | Sigma Aldrich | C2432 | For washing of slides. |
| Glacial Acetic Acid | Sigma Aldrich | ARK2183 | For washing of slides. |
| Tris HCL pH 8.8 | Sigma Aldrich | TRIS-RO | For proteolytic cleavage. Powder made to 1M followed by equilibration with 32% HCl to PH 8.8 |
| Milli Q Ultra-Pure Water | Sigma Aldrich | NA | For proteolytic cleavage. Purification performed in house by sartorious water purification system |
| Ammonium Bircarbonate | Sigma Aldrich | A6141 | For proteolytic cleavage. |
| Trypsin | Sigma Aldrich | T0303 | For proteolytic cleavage. |
| CHCA Matrix | Sigma Aldrich | C2020 | For recrystallisation. |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 1.00029 | For recrystallisation. |
| Trifluoroacetic Acid (TFA) | Sigma Aldrich | 302031 | For recrystallisation. |
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