Zika 바이러스 특정 진단 Epitope 발견
Summary
이 프로토콜에서 우리 Zika 바이러스 특정 진단 펩 티 드 고밀도 펩타이드 microarray를 사용 하 여 발견 하는 기법을 설명 합니다. 이 프로토콜 readly 다른 신흥 감염 증에 대 한 적응 될 수 있다.
Abstract
고밀도 펩타이드 microarrays 단일 표준 현미경 슬라이드에서 6 천 이상의 펩 티 드의 심사를 허용합니다. 이 방법은 약물 발견, 치료 대상 식별 및 개발에 적용할 수 있습니다 진단의. 여기, 선물이 특정 Zika 바이러스 (ZIKV) 진단 펩 티 드 고밀도 펩타이드 microarray를 사용 하 여 발견 하는 프로토콜. 인간의 혈 청 샘플 ZIKV 감염 14-aa 잔류물 중복 3,423 독특한 15 선형 아미노산 (aa) 잔류물으로 번역 전체 ZIKV 단백질을 포함 하는 고밀도 펩 티 드 microarray와 알을 품는 대 한 유효성 검사 중복에서 인쇄. 동일한 배열 내에서 다른 이차 항 체와 얼룩, 우리 면역 글로불린 M (IgM) 및 혈 청에 있는 항 체는 면역 글로불린 G (IgG)에 바인딩되는 펩 티 드를 발견 했습니다. 이러한 펩 티이 드 추가 검증 실험에 대 한 선정 됐다. 이 프로토콜에서 우리는 디자인, 처리, 그리고 고밀도 펩타이드 microarray 분석 전략을 설명 합니다.
Introduction
Zika 바이러스 (ZIKV) 진단에 따라 임상 증상은 뎅 그 열과 Chikungunya 바이러스 감염1벡터, 지리적 분포와 증상을 공유 하기 때문에 도전 이다. 여자 임신 중 ZIKV 감염에 불리 한 임신 결과 대 한 위험을 감안할 때, 그것은 3 바이러스 사이 구별 하는 것이 중요. 현재 분자 진단 테스트 특정 있지만, 그들은 단지 혈액 이나 타 액에 유용 급성 감염2,3의 상대적으로 짧은 기간 동안. 혈 청 학적인 분석 실험 진단 감염4의이 초기 기간이 필수적입니다.
ZIKV 특정 혈 청 학적인 분석 결과의 개발은 두 가지 이유로 도전: 첫째, 인간의 면역 체계에 응답 Zika 항 현재 알려져 있지 않습니다; 그리고 두 번째, 보존 flaviviruses 아미노산 시퀀스 유도 항 체 분. 우리의 목표는 독특한 ZIKV 특정 펩 티 드 진단에 사용할 수 발견 했다. 다른 방법을 개발 되었으며, 살 균 소, 세균를 포함 하 여 전체 단백질을 다루는 화면 펩타이드 라이브러리 및 효 모 표면 표시5,6,7,,89, 10. 우리의 전략은 신속 하 고 저렴 한 높은 처리량 serological 검사11,12 를 허용 하는 고밀도 펩타이드 microarray를 사용 하 고 이후에 확인 된 펩 티 드 serological 전류를 향상 시키기 위해 사용할 수 있습니다. ZIKV 감염의 탐지를 위한 분석 실험입니다.
이 프로토콜 Zika 바이러스 특정 진단 펩 티 드의 고밀도 펩타이드 microarray (그림 1)를 사용 하 여 검색을 수 있습니다. 고밀도 펩 티 드 microarray 펩 티 드 레이저 인쇄 기술을 사용 하 여 제작 되었다. 프랑스 폴리네시아 스트레인 기반 3,423 아미노산 잔류물의 구성 된 전체 ZIKV 단백질 시퀀스 (은행: KJ776791.2), 표준 유리 슬라이드에 대 한 중복 14 아미노산 잔류물의 중복 15 선형 잔류물의 블록에서에 인쇄 되었다는 총 6,846 펩 티 드 명소입니다. 전체 Zika 단백질 시퀀스 펩 티 드, 이외는 microarray 인플루엔자 조류 활용 (HA) 펩 티 드 내부 통제에 대 한.
Zika 검증 긍정적인 워즈워스 센터 (알바 니, 뉴욕)에서 얻은 혈 청 샘플 특정 면역 글로불린 M (IgM) 및 면역 글로불린 G (IgG) 반응 펩 티 드 식별 하는 데 사용 되었다. 밤새 샘플 잠복기 후에 microarray는 보조 형광 색소 활용 된 항 체 (반대로 인간 IgM 또는 반대로 인간 IgG), 물 고 microarray 스캐너에 분석. 자리 농도 및 펩 티 드 주석의 정량화는 microarray 제조 같은 회사에 의해 제공 하는 특정 소프트웨어와 함께 수행 되었다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 프로토콜을 포함 하는 전체 Zika 바이러스 단백질 시퀀스 (프랑스어 폴 리 네 시안 스트레인) 고밀도 펩 티 드 microarray를 이용 하 여 설계 되었습니다. microarray 인쇄 3,423 다른 겹치는 선형 펩 티 드에 의해 제조 되었다. 각 펩 티 드 아미노산 15 이었고 시퀀스 (즉, 14 잔류물 오버랩)에 가까운 이웃에서 한 잔류물에 의해 다양 한. 비록 짧은 겹침 인쇄 될 수 있다, epitope 매핑은 더 이상 중?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
현재 지원 NIDCRR44 DE024456에서 SBIR (중소 기업 혁신 연구) 관리 보충 그랜트에 의해 제공 됩니다. 에이즈에 대 한 확실 한 포인트의 의료 진단의 개발에 대 한 NIDCR 부여 U01 DE017855 진화 NIDCR 에이즈 그랜트. 우리는 기꺼이 그녀의 기술 지원 및 지원 종류에 대 한 질 케 Weisenburger(PEPperPRINT Heidelberg, Germany)를 인정합니다. 우리는 또한 리 오호 오디세이 이미징 시스템에 대 한 NYU Langone 의료 센터 감사합니다.
Materials
| PEPperCHIP Custom Peptide Microarray | PEPperPRINT | PPC.001.001 | Custom peptide micarray: our microarray contains the entire Zika virus protein sequence |
| PEPperCHIP incubation tray 3/1 | PEPperPRINT | PPC.004.001 | |
| PEPperCHIP Staining Kit (680 nm) (anti-HA, DyLight labeling) | PEPperPRINT | PPC.037.002 | |
| PepSLide Analyzer | PEPperPRINT | PSA.004.001 | 14-days free License for Windows |
| Rockland Blocking buffer | Rockland | MB-070 | |
| anti-human IgM (mu chain) DyLight 800 | Rockland | 609-145-007 | |
| anti-human IgG Fc DyLight 680 | Thermo Scientific | SA5-10138 | |
| LI-COR Odyssey Imaging System | LI-COR | ||
| Orbital shaker device | IKA | MTS 2/4 digital microtiter shaker | |
| Adobe Illustrator | Adobe | ||
| Deltagraph | Redrocks |
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