اكتشاف حانمه تشخيصية محددة الفيروس Zika
Summary
في هذا البروتوكول، يصف لنا تقنية لاكتشاف الببتيدات زيكا تشخيصية محددة الفيروس استخدام ميكرواري ببتيد عالية الكثافة. هذا البروتوكول يمكن تكييفها مع ريادلي للأمراض المعدية الناشئة.
Abstract
[ميكروارس] هضميد عالي الكثافة السماح الفرز لأكثر من ستة آلاف الببتيدات على شريحة مجهرية معيار واحد. ويمكن تطبيق هذا الأسلوب لاكتشاف المخدرات وتحديد الهدف العلاجي، ووضع التشخيص. نقدم هنا، بروتوكول اكتشاف محددة Zika الفيروسات (زيكف) التشخيص الببتيدات استخدام ميكرواري ببتيد عالية الكثافة. طباعة عينة مصل الإنسان التحقق من صحة للإصابة زيكف كان المحتضنة مع ميكرواري ببتيد عالي الكثافة التي تحتوي على بروتين زيكف كامل ترجمة فريدة من نوعها 3,423 15 من مخلفات الخطي من الأحماض الأمينية (أإ) مع تداخل بقايا 14-aa مكررة. تلطيخ مع الأجسام المضادة الثانوية المختلفة داخل نفس الصفيف، اكتشفنا الببتيدات التي تربط غلوبيولين مناعي M (IgM) والأجسام المضادة “ز الغلوبولين المناعي” (IgG) في مصل الدم. واختيرت هذه الببتيدات لمزيد من التحقق من صحة التجارب. في هذا البروتوكول، يصف لنا الاستراتيجية المتبعة لتصميم ومعالجة وتحليل ميكرواري ببتيد عالي الكثافة.
Introduction
تشخيص الفيروس (زيكف) Zika استناداً إلى الأعراض السريرية يمثل تحديا نظراً لأنها تشاطر نواقل، والتوزيع الجغرافي، والأعراض بحمى الضنك وداء شيكونغونيا الإصابة بالفيروس1. نظراً للخطر لنتائج الحمل السلبية في النساء المصابات زيكف أثناء الحمل، من المهم التمييز بين الفيروسات 3. على الرغم من أن اختبارات التشخيص الجزيئي الحالية محددة، أنها مفيدة فقط في الدم أو اللعاب خلال فترة قصيرة نسبيا من الإصابة الحادة2،3. الاختبارات المصلية ضرورية للتشخيص خارج هذه الفترة الأولية من الإصابة4.
تطوير زيكف المقايسة المصلية محددة يمثل تحديا لسببين: أولاً، ليست معروفة حاليا المستضدات Zika يستجيب جهاز المناعة البشري؛ وتسلسل الأحماض الأمينية فلافيفيروسيس الثاني، وحفظت حمل جسم ه. وكان هدفنا لاكتشاف فريد زيكف الببتيدات محددة لاستخدامها في تشخيص. وضعت نهج مختلفة للشاشة الببتيد مكتبات تغطي كامل البروتينات بما في ذلك بالعاثية، البكتيرية، وعرض سطح الخميرة5،،من67،،من89، 10. كان لدينا استراتيجية لاستخدام ميكرواري ببتيد عالية الكثافة التي تسمح بالفحوص المصلية سريعة وغير مكلفة في الفائق11،12 ، وبعد ذلك يمكن استخدام الببتيدات التي تم تحديدها لتحسين الحالية المصلية فحوصات للكشف عن الإصابة زيكف.
ويتيح هذا البروتوكول اكتشاف الببتيدات Zika تشخيصية محددة الفيروس استخدام ميكرواري ببتيد عالي الكثافة (الشكل 1). وأنتج ميكرواري الببتيد عالي الكثافة باستخدام تكنولوجيا الطباعة الليزر الببتيد. تسلسل البروتين زيكف أسرة تتألف من بقايا الأحماض الأمينية 3,423 استناداً إلى سلالة بولينيزيا الفرنسية (بنك الجينات: KJ776791.2)، تمت طباعته على شريحة زجاج قياسية في كتل من بقايا خطي 15 مع تداخل 14 مخلفات الأحماض الأمينية في تكرار إجمالي 6,846 الببتيد البقع. بالإضافة إلى أسرة Zika بروتين تسلسل الببتيدات، يستخدم ميكرواري هيماغلوتينين إنفلونزا الببتيدات (ها) للضوابط الداخلية.
زيكا التحقق من صحة إيجابية المصل العينة التي تم الحصول عليها من مركز ادسورث (ألباني، نيويورك)، استخدمت لتحديد محددة غلوبيولين مناعي M (IgM) والببتيدات رد الفعل “ز الغلوبولين المناعي” (IgG). بعد حضانة مع العينة بين عشية وضحاها، ميكرواري ملطخة بجسم مترافق fluorochrome ثانوي (IgM المضادة الإنسان أو الإنسان المضادة IgG)، وحلل على ماسح ضوئي ميكرواري. التحديد الكمي لكثافة بقعة والشرح الببتيد أجرى مع برمجيات خاصة المقدمة من نفس الشركة المصنعة ميكرواري.
Protocol
Representative Results
Discussion
لقد قمنا بتصميم بروتوكول استخدام ميكرواري ببتيد عالي الكثافة التي تحتوي على تسلسل البروتين فيروس زيكا كامل (سلالة بولينيزيا الفرنسية). ميكرواري تم تصنيعها من قبل الطباعة الببتيدات 3,423 مختلفة الخطية المتداخلة. وكان 15 من الأحماض الأمينية كل الببتيد ومتنوعة من بقايا واحد فقط من جارتها الأقر…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الدعم الحالي من قبل منحة ملحق إداري SBIR (بحوث الابتكار الأعمال الصغيرة) من NIDCRR44 DE024456. منح منحة NIDCR فيروس نقص المناعة البشرية التي تطورت من أصل NIDCR U01 DE017855 لوضع تشخيص نقطة الرعاية المؤكدة لفيروس نقص المناعة البشرية. ونعترف Weisenburger(PEPperPRINT Heidelberg, Germany) سيلك امتنان للمساعدة التقنية والدعم الكريم. ونشكر أيضا جامعة نيويورك Langone المركز الطبي للي كو “أوديسي التصوير النظام”.
Materials
| PEPperCHIP Custom Peptide Microarray | PEPperPRINT | PPC.001.001 | Custom peptide micarray: our microarray contains the entire Zika virus protein sequence |
| PEPperCHIP incubation tray 3/1 | PEPperPRINT | PPC.004.001 | |
| PEPperCHIP Staining Kit (680 nm) (anti-HA, DyLight labeling) | PEPperPRINT | PPC.037.002 | |
| PepSLide Analyzer | PEPperPRINT | PSA.004.001 | 14-days free License for Windows |
| Rockland Blocking buffer | Rockland | MB-070 | |
| anti-human IgM (mu chain) DyLight 800 | Rockland | 609-145-007 | |
| anti-human IgG Fc DyLight 680 | Thermo Scientific | SA5-10138 | |
| LI-COR Odyssey Imaging System | LI-COR | ||
| Orbital shaker device | IKA | MTS 2/4 digital microtiter shaker | |
| Adobe Illustrator | Adobe | ||
| Deltagraph | Redrocks |
References
- Kelser, E. A. Meet dengue’s cousin. Zika. Microbes Infect. 18 (3), 163-166 (2016).
- Musso, D., et al. Detection of Zika virus in saliva. J Clin Virol. 68, 53-55 (2015).
- Siqueira, W. L., et al. Oral Clinical Manifestations of Patients Infected with Zika Virus. Oral Health. , (2016).
- Duarte, G. Challenges of Zika Virus Infection in Pregnant Women. Rev Bras Ginecol Obstet. 38 (6), 263-265 (2016).
- Buus, S., et al. High-resolution mapping of linear antibody epitopes using ultrahigh-density peptide microarrays. Mol Cell Proteomics. 11 (12), 1790-1800 (2012).
- Kouzmitcheva, G. A., Petrenko, V. A., Smith, G. P. Identifying diagnostic peptides for lyme disease through epitope discovery. Clin Diagn Lab Immunol. 8 (1), 150-160 (2001).
- Hamby, C. V., Llibre, M., Utpat, S., Wormser, G. P. Use of Peptide library screening to detect a previously unknown linear diagnostic epitope: proof of principle by use of lyme disease sera. Clin Diagn Lab Immunol. 12 (7), 801-807 (2005).
- t Hoen, P. A., et al. Phage display screening without repetitious selection rounds. Anal Biochem. 421 (2), 622-631 (2012).
- Townend, J. E., Tavassoli, A. Traceless Production of Cyclic Peptide Libraries in E. coli. ACS Chem Biol. 11 (6), 1624-1630 (2016).
- Turchetto, J., et al. High-throughput expression of animal venom toxins in Escherichia coli to generate a large library of oxidized disulphide-reticulated peptides for drug discovery. Microbial Cell Factories. 16 (1), 6 (2017).
- Carmona, S. J., Sartor, P. A., Leguizamon, M. S., Campetella, O. E., Aguero, F. Diagnostic Peptide Discovery: Prioritization of Pathogen Diagnostic Markers Using Multiple Features. Plos One. 7 (12), e50748 (2012).
- Lagatie, O., Van Dorst, B., Stuyver, L. J. Identification of three immunodominant motifs with atypical isotype profile scattered over the Onchocerca volvulus proteome. PLoS Negl Trop Dis. 11 (1), e0005330 (2017).
- Basile, A. J. Development and validation of an ELISA kit (YF MAC-HD) to detect IgM to yellow fever virus. J Virol Methods. 225, 41-48 (2015).
- Madden, T. The BLAST Sequence Analysis Tool. The NCBI Handbook. , (2013).
- Services, U. S. D. o. H. a. H. . Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). , (2009).
- Pellois, J. P., et al. Individually addressable parallel peptide synthesis on microchips. Nat Biotech. 20 (9), 922-926 (2002).
- Stafford, P., et al. Physical Characterization of the “Immunosignaturing Effect”. Mol Cell Proteomics. 11 (4), (2012).
- Gardner, T. J., et al. Functional screening for anti-CMV biologics identifies a broadly neutralizing epitope of an essential envelope protein. Nat Commun. 7, (2016).
- Nixon, C. E., et al. Identification of protective B-cell epitopes within the novel malaria vaccine candidate P. falciparum Schizont Egress Antigen-1. Clin Vaccine Immunol. , (2017).
