Zikaviruset specifika diagnostiska epitop Discovery
Summary
I detta protokoll beskriver vi en teknik för att upptäcka Zika virus specifika diagnostiska peptider med en hög densitet peptid microarray. Detta protokoll kan readly anpassas för andra framväxande infektionssjukdomar.
Abstract
Hög densitet peptid microarrays tillåta screening av mer än sex tusen peptider på en enda standard mikroskopi bild. Denna metod kan tillämpas för läkemedelsutveckling, terapeutiska target identifiering och utveckling av diagnostik. Här presenterar vi ett protokoll för att upptäcka specifika Zika virus (ZIKV) diagnostiska peptider med en hög densitet peptid microarray. Ett humant serumprov validerade för ZIKV infektion var inkuberas med en hög densitet peptid microarray som innehåller hela ZIKV proteinet översatt till 3 423 unika 15 linjär aminosyra (aa) rester med en 14-aa rester överlappning tryckt i två exemplar. Färgning med olika sekundära antikroppar inom samma matrisen, upptäckt vi peptider som binder till immunglobulin M (IgM) och immunglobulin G (IgG)-antikroppar i serum. Dessa peptider valdes för ytterligare validering experiment. I detta protokoll beskriver vi den strategi som följts för att utforma, bearbeta och analysera en hög densitet peptid microarray.
Introduction
Zika virus (ZIKV) diagnos baserad på kliniska symtom utmanande eftersom den delar vektorer, geografisk spridning och symtom med denguefeber och Chikungunya virus infektion1. Med tanke på risken för oönskade graviditeter hos kvinnor som smittats med ZIKV under graviditet, är det viktigt att skilja mellan de 3 virus. Även de molekylära diagnostik testerna är specifika, är de endast användbar i blod eller saliv under den relativt korta perioden av akut infektion2,3. Serologiska analyser är väsentliga för diagnosen utanför denna inledande period infektion4.
Utvecklingen av en ZIKV specifika serologiska test är utmanande av två skäl: först, de Zika antigener som människans immunsystem reagerar på inte är för närvarande kända; och andra, bevarade flavivirus amino syra ordnar inducera antikroppar korsreaktivitet. Vårt mål var att upptäcka unika ZIKV särskilda peptider som ska användas i diagnostik. Olika metoder har utvecklats till skärmen peptid bibliotek som täcker hela proteiner inklusive phage, bakteriell, och jäst ytan Visa5,6,7,8,9, 10. Vår strategi var att använda en hög densitet peptid microarray som tillåter snabb och billig hög genomströmning serologiska filmvisningar11,12 och därefter de identifiera peptiderna kan användas för att förbättra nuvarande serologiska analyser för detektion av ZIKV infektion.
Detta protokoll kan upptäckten av Zika virus specifika diagnostiska peptider med en hög densitet peptid microarray (figur 1). Högdensitets peptid microarray producerades med hjälp av peptiden laser utskrift teknik. Hela ZIKV protein sekvensen bestående av 3 423 aminosyra rester baserat på den franska polynesiska stammen (GenBank: KJ776791.2), trycktes på en vanlig glasskiva i Block 15 linjär resthalter överlappning av 14 aminosyra rester i duplikat för en totalt 6.846 peptid ställen. Förutom hela Zika protein sequence peptiderna, microarray använder tredjeparts influensa hemagglutinin (HA) peptider för interna kontroller.
En Zika validerade positiva serumprov som erhållits från Wadsworth Center (Albany, NY), användes för att identifiera specifika immunglobulin M (IgM) och immunglobulin G (IgG) reaktiv peptider. Efter inkubation med provet över natten, var microarray målat med en sekundär fluorokrom konjugerad antikropp (anti-humant IgM eller anti-humant IgG), och analyseras på en microarray skanner. Kvantifiering av spot stödnivåer och peptid annotation utfördes med en särskild programvara som tillhandahålls av samma företag som tillverkat microarray.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi utformade ett protokoll som använder en hög densitet peptid microarray som innehåller hela Zika virus protein sekvensen (franska polynesiska stam). Microarray tillverkades av utskrift 3 423 olika överlappande linjär peptider. Varje peptid var 15 aminosyror och varierade efter endast en rester från närmsta granne i sekvensen (dvs, 14 rester överlappning). Även om kortare överlappningar kan skrivas, är epitop mappning mer exakt med längre överlappningar. Varje peptid trycktes i dubblett att öka ti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dagens stöd tillhandahålls av ett SBIR (Small Business Innovation Research) administrativa tillägg stipendium från NIDCRR44 DE024456. NIDCR HIV-anslaget som utvecklats ur NIDCR bevilja U01 DE017855 för utvecklingen av en bekräftande point-of-care-diagnostik för HIV. Vi erkänner tacksamt Silke Weisenburger(PEPperPRINT Heidelberg, Germany) för hennes tekniskt stöd och vänliga support. Vi tackar också NYU Langone Medical Center för LI-COR Odyssey Imaging System.
Materials
| PEPperCHIP Custom Peptide Microarray | PEPperPRINT | PPC.001.001 | Custom peptide micarray: our microarray contains the entire Zika virus protein sequence |
| PEPperCHIP incubation tray 3/1 | PEPperPRINT | PPC.004.001 | |
| PEPperCHIP Staining Kit (680 nm) (anti-HA, DyLight labeling) | PEPperPRINT | PPC.037.002 | |
| PepSLide Analyzer | PEPperPRINT | PSA.004.001 | 14-days free License for Windows |
| Rockland Blocking buffer | Rockland | MB-070 | |
| anti-human IgM (mu chain) DyLight 800 | Rockland | 609-145-007 | |
| anti-human IgG Fc DyLight 680 | Thermo Scientific | SA5-10138 | |
| LI-COR Odyssey Imaging System | LI-COR | ||
| Orbital shaker device | IKA | MTS 2/4 digital microtiter shaker | |
| Adobe Illustrator | Adobe | ||
| Deltagraph | Redrocks |
References
- Kelser, E. A. Meet dengue’s cousin. Zika. Microbes Infect. 18 (3), 163-166 (2016).
- Musso, D., et al. Detection of Zika virus in saliva. J Clin Virol. 68, 53-55 (2015).
- Siqueira, W. L., et al. Oral Clinical Manifestations of Patients Infected with Zika Virus. Oral Health. , (2016).
- Duarte, G. Challenges of Zika Virus Infection in Pregnant Women. Rev Bras Ginecol Obstet. 38 (6), 263-265 (2016).
- Buus, S., et al. High-resolution mapping of linear antibody epitopes using ultrahigh-density peptide microarrays. Mol Cell Proteomics. 11 (12), 1790-1800 (2012).
- Kouzmitcheva, G. A., Petrenko, V. A., Smith, G. P. Identifying diagnostic peptides for lyme disease through epitope discovery. Clin Diagn Lab Immunol. 8 (1), 150-160 (2001).
- Hamby, C. V., Llibre, M., Utpat, S., Wormser, G. P. Use of Peptide library screening to detect a previously unknown linear diagnostic epitope: proof of principle by use of lyme disease sera. Clin Diagn Lab Immunol. 12 (7), 801-807 (2005).
- t Hoen, P. A., et al. Phage display screening without repetitious selection rounds. Anal Biochem. 421 (2), 622-631 (2012).
- Townend, J. E., Tavassoli, A. Traceless Production of Cyclic Peptide Libraries in E. coli. ACS Chem Biol. 11 (6), 1624-1630 (2016).
- Turchetto, J., et al. High-throughput expression of animal venom toxins in Escherichia coli to generate a large library of oxidized disulphide-reticulated peptides for drug discovery. Microbial Cell Factories. 16 (1), 6 (2017).
- Carmona, S. J., Sartor, P. A., Leguizamon, M. S., Campetella, O. E., Aguero, F. Diagnostic Peptide Discovery: Prioritization of Pathogen Diagnostic Markers Using Multiple Features. Plos One. 7 (12), e50748 (2012).
- Lagatie, O., Van Dorst, B., Stuyver, L. J. Identification of three immunodominant motifs with atypical isotype profile scattered over the Onchocerca volvulus proteome. PLoS Negl Trop Dis. 11 (1), e0005330 (2017).
- Basile, A. J. Development and validation of an ELISA kit (YF MAC-HD) to detect IgM to yellow fever virus. J Virol Methods. 225, 41-48 (2015).
- Madden, T. The BLAST Sequence Analysis Tool. The NCBI Handbook. , (2013).
- Services, U. S. D. o. H. a. H. . Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). , (2009).
- Pellois, J. P., et al. Individually addressable parallel peptide synthesis on microchips. Nat Biotech. 20 (9), 922-926 (2002).
- Stafford, P., et al. Physical Characterization of the “Immunosignaturing Effect”. Mol Cell Proteomics. 11 (4), (2012).
- Gardner, T. J., et al. Functional screening for anti-CMV biologics identifies a broadly neutralizing epitope of an essential envelope protein. Nat Commun. 7, (2016).
- Nixon, C. E., et al. Identification of protective B-cell epitopes within the novel malaria vaccine candidate P. falciparum Schizont Egress Antigen-1. Clin Vaccine Immunol. , (2017).
