Mikroskopi basert metoder for vurdering av epitelial celle migrasjon ved In Vitro sårheling
Summary
Denne oppgaven beskriver hvordan snitt-lignende lesjoner på kulturperler tarmepitelet monolayers praktisk modell sår helbredelse i vitro, muliggjør bildebehandling av AC confocal eller laser skanning mikroskopi, og som kan gi høy kvalitet kvantitative og kvalitative data for å studere både celle atferd og mekanismene som er involvert i migrasjon.
Abstract
Celle migrasjon er en obligatorisk del for sårtilheling. Lage kunstige sår på forskning dyremodeller resulterer ofte i kostbart og komplisert eksperimentelle prosedyrer, mens potensielt mangler i presisjon. In vitro kultur epithelial cellelinjer gir en passende plattform for forskning celle vandrende virkemåten sårheling og virkningen av behandlinger på disse cellene. Fysiologi av epitelceller er ofte studert i ikke-confluent forhold; men kan denne tilnærmingen ikke ligner naturlig sårheling forhold. Forstyrre epitel integriteten av mekaniske midler genererer en realistisk modell, men kan hindre bruk av molekylære teknikker. Følgelig mikroskopi basert teknikker er optimal for å studere epithelial celle migrasjon i vitro. Her detalj vi to bestemte metoder, kunstige såret scratch analysen og kunstig migrasjon foran analysen, som kan få kvantitative og kvalitative data, henholdsvis på vandrende resultatene av epitelceller.
Introduction
Celle migrasjon er nødvendige for sårheling, som er ansvarlig for endelig nedleggelsen av epitelial gapet og restaurering av forstyrret overflaten1. Utføre kunstig sår i dyremodeller tillater replikering av denne komplekse prosessen i nær fysiologiske forhold2. Men resulterer denne tilnærmingen ofte i kostbare og komplisert eksperimentelle prosedyrer, som potensielt mangler presisjon for studier av ulike prosesser, på grunn av intrikate natur sårhelende prosessen.
In vitro kultur epithelial cellelinjer gir et nyttig alternativ til dyr modeller for forskning rollen som disse cellene spille sårheling og effekten av behandling på cellen vandrende atferd. Fysiologi av epitelceller er ofte studert av molekylære teknikker bruker ikke-confluent kulturer3,4,5,6; Imidlertid er avbrudd i epitel integritet vanligvis oppnås ved fine mekanisk snitt. I cellekultur innebærer dette at ubetydelig antall celler kan bli utsatt for såret gapet, og de representerer et for lite utvalg for molekylærbiologi teknikker. Men kan disse lesjoner studeres på mikroskopisk skalaen, utnytter den medfødte vandrende egenskaper noen epithelial cellelinjer som Mink lunge Epithelial cellen (Mv1Lu) eller spontant udødeliggjort menneskelige keratinocyte (HaCaT) cellen linjer.
Her beskrev vi en metode for mikroskopi som passer å få kvantitative data om migrasjon av epitelceller i sammenheng med sårheling3,4,7,8. Dessuten, presenterer vi flere metoder som er nyttig å studere kvalitativt molekylære og morfologiske omveltningene på epithelial monolayers under overføringen. Samlet gir disse metodene en ramme for å studere både dynamikk og morfologiske endringer med tarmepitelet atferd og svar på behandlinger under sårtilheling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ved huden eller slimhinnene avbrudd gjenopprettes barriere funksjonen handlingene til mange celletyper, inkludert fibroblaster eller epitel og immunsystemet cellene. Conjointly, disse cellene gjennomgår en kompleks prosess som involverer apoptose, spredning, differensiering, og viktigst, fibroblast og epithelial celle overføringen, som er den ultimate mekanismen ansvarlig for restaurering av forstyrret vev og nedleggelsen av overflatiske epiteliale gapet1,12 al…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi ønsker å takke eldre medlemmer av laboratoriet som bidrar til å forbedre og finpusse disse teknikkene til faktiske tilstand: Dr. Celia Martinez-Mora; Dr. Anna Mrowiec, Dr. Catalina Ruiz-Cañada og Dr. Antonia Alcaraz-García. Vi er gjeld til sykehuset Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca for sterkt støtte utviklingen av disse teknikkene. Også i Instituto de Salud Carlos III, Fondo de Investigaciones Sanitarias. Planlegge Estatal jeg + D + jeg og Instituto de Salud Carlos III-Subdirección General de Evaluación y Fomento de la Investigación (Grant nr: PI13/00794); www.isciii.es. Fondos FEDER “Una manera de hacer Europa”. Vi takker også Universitetet i Murcia, IMIB-Arrixaca og FFIS for Administrativ støtte og hjelp. Til slutt, vi ønsker å gi en spesiell takk til Dr. Isabel Martínez-Argudo og de Facultad de Ciencias Ambientales y Bioquímica, Campus Tecnológico de la Fábrica de Armas, Universidad Castilla la Mancha Toledo for vennlig støtte i frivillig avstå den Biomedisin og bioteknologi laboratoriet for å muliggjøre delen filmet i dette papiret.
Materials
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Biowest, Nuaillé, France | L0102-500 | Optional 10 % FBS supplement |
| Eagles’s Minimum Essential Medium (EMEM) | Lonza | BE12 -662F | Optional 10 % FBS supplement |
| L-Glutamine | Lonza | BE17-605E | Use at 2 mM |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA | DE17603A | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | T4049 | Dilute as appropriate |
| Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | P9155 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (10x) | Gibco by Life Technologies | 14200-067 | Dilute to 1x |
| 24-well culture plates | BD FALCON//SARSTED | 734-0020 | |
| 6-well culture plates | SARSTEDT | 83-3920 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | E9644 | Used 10 ng/mL |
| Round cover glass | MENZEL-GLÄSER | MENZCB00120RA020 | SHORT DEPTH OF FIELD |
| Reinforced razor blade no. 743 | Martor (through VWR) | MARO743.50 | |
| 200 µl sterile aerosol pipet tips | VWR | 732-0541 | |
| 20 µl sterile aerosol pipet tips | VWR | 732-0528 | |
| Digital camera coupled phase contrast microscope | Motic Spain | Moticam camera 2300 3.0 M Pixel USB 2.0; Motic Optic AE31 | |
| Confocal microscope | ZEISS Microimaging, Germany | LSM 510 META | |
| 10 cm Culture dish | BD FALCON | 353003 | |
| Rabbit polyclonal anti c-Jun antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-1694 | Used 1:100 |
| Anti-rabbit IgG (polyclonal goat ) AF 488 | Invitrogen | A11008 | Used 1:400 |
| Hoechst-33258 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | 14530 | Used 1:1000 |
| Alexa Fluor 594 phalloidin (in methanol) (red) | Invitrogen | A12381 | Used 1:100 |
| Bovine Serum Albumin | Santa Cruz Biotechnology | SC-2323 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | T9284 | |
| Skim milk | BD DIFCO | 232100 | |
| ImageJ | National Institutes of Health, USA | Release 1.50i | |
| Zen LSM 510 image processing software | ZEISS Microimaging, Germany | Release 5.0 SP 1.1 |
References
- Singer, A. J., Clark, R. A. Cutaneous wound healing. N Engl J Med. 341 (10), 738-746 (1999).
- Davidson, J. M. Animal models for wound repair. Arch Dermatol Res. 290, S1-S11 (1998).
- Alcaraz, A., et al. Amniotic Membrane Modifies the Genetic Program Induced by TGFss, Stimulating Keratinocyte Proliferation and Migration in Chronic Wounds. PLoS One. 10 (8), e0135324 (2015).
- Ruiz-Canada, C., et al. Amniotic membrane stimulates cell migration by modulating Transforming Growth Factor-beta signaling. J Tissue Eng Regen Med. , (2017).
- Schmierer, B., Hill, C. S. TGFbeta-SMAD signal transduction: molecular specificity and functional flexibility. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 970-982 (2007).
- Hu, Y. L., et al. FAK and paxillin dynamics at focal adhesions in the protrusions of migrating cells. Sci Rep. 4, 6024 (2014).
- Martinez-Mora, C., et al. Fibroin and sericin from Bombyx mori silk stimulate cell migration through upregulation and phosphorylation of c-Jun. PloS one. 7 (7), e42271 (2012).
- Bernabe-Garcia, A., et al. Oleanolic acid induces migration in Mv1Lu and MDA-MB-231 epithelial cells involving EGF receptor and MAP kinases activation. PLoS One. 12 (2), e0172574 (2017).
- Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. J Biomed Sci. 17, 36 (2010).
- Liberio, M. S., Sadowski, M. C., Soekmadji, C., Davis, R. A., Nelson, C. C. Differential effects of tissue culture coating substrates on prostate cancer cell adherence, morphology and behavior. PLoS One. 9 (11), e112122 (2014).
- Pierreux, C. E., Nicolas, F. J., Hill, C. S. Transforming growth factor beta-independent shuttling of Smad4 between the cytoplasm and nucleus. Mol Cell Biol. 20 (23), 9041-9054 (2000).
- Barrientos, S., Stojadinovic, O., Golinko, M. S., Brem, H., Tomic-Canic, M. Growth factors and cytokines in wound healing. Wound repair and regeneration: official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 16 (5), 585-601 (2008).
- Ansell, D. M., Holden, K. A., Hardman, M. J. Animal models of wound repair: Are they cutting it?. Exp Dermatol. 21 (8), 581-585 (2012).
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453 (7193), 314-321 (2008).
- Insausti, C. L., et al. Amniotic membrane induces epithelialization in massive posttraumatic wounds. Wound Repair Regen. 18 (4), 368-377 (2010).
- Wu, F., et al. Cell cycle arrest in G0/G1 phase by contact inhibition and TGF-beta 1 in mink Mv1Lu lung epithelial cells. Am J Physiol. 270 (5 Pt 1), L879-L888 (1996).
- Boukamp, P., et al. Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line. J Cell Biol. 106 (3), 761-771 (1988).
- Marshall, J., Wells, C. M., Parsons, M. . Cell Migration: Developmental Methods and Protocols. , 97-110 (2011).
- Nyegaard, S., Christensen, B., Rasmussen, J. T. An optimized method for accurate quantification of cell migration using human small intestine cells. Metabolic Engineering Communications. 3, 76-83 (2016).
- Szybalski, W., Iyer, V. N. Crosslinking of DNA by Enzymatically or Chemically Activated Mitomycins and Porfiromycins, Bifunctionally “Alkylating” Antibiotics. Fed Proc. 23, 946-957 (1964).
- Tomasz, M. Mitomycin C: small, fast and deadly (but very selective). Chem Biol. 2 (9), 575-579 (1995).
- Sherry, D. M., Parks, E. E., Bullen, E. C., Updike, D. L., Howard, E. W. A simple method for using silicone elastomer masks for quantitative analysis of cell migration without cellular damage or substrate disruption. Cell Adh Migr. 7 (6), 469-475 (2013).
- Dennis, E. A., Rhee, S. G., Billah, M. M., Hannun, Y. A. Role of phospholipase in generating lipid second messengers in signal transduction. FASEB J. 5 (7), 2068-2077 (1991).
- Lampugnani, M. G. Cell migration into a wounded area in vitro. Methods Mol Biol. 96, 177-182 (1999).
