Métodos basados en microscopía para la evaluación de la migración de células epiteliales durante la cicatrización de la herida In Vitro
Summary
Este manuscrito describe cómo incisión-como lesiones sobre monocapas de células epiteliales cultivadas convenientemente modelo herida curativo en vitro, permitiendo la proyección de imagen de confocal o microscopia de la exploración del laser, y que puede proporcionar alta calidad datos cuantitativos y cualitativos para el estudio de comportamiento de la célula y los mecanismos implicados en la migración.
Abstract
Migración celular es un aspecto obligatorio de la cicatrización de heridas. Creación artificial heridas en modelos animales de investigación a menudo resultados en procedimientos experimentales costosos y complicados, mientras que potencialmente carece de precisión. Cultivo in vitro de líneas celulares epiteliales proporciona una plataforma conveniente para investigar el comportamiento migratorio de células en la cicatrización de heridas y el impacto de los tratamientos en estas células. La fisiología de las células epiteliales se estudia a menudo en condiciones no-confluentes; sin embargo, este enfoque no puede asemejarse a las condiciones de cicatrización natural. Alterar la integridad del epitelio por medio mecánico genera un modelo realista, pero puede impedir la aplicación de técnicas moleculares. Por lo tanto, técnicas de microscopía basado son óptimas para estudiar la migración de células epiteliales in vitro. Aquí se detallan dos métodos específicos, el ensayo de rayado herida artificial y el análisis de frente de migración artificial, que puede obtener datos cuantitativos y cualitativos, respectivamente, sobre el comportamiento migratorio de las células epiteliales.
Introduction
Migración celular es necesaria para la cicatrización de heridas, ya que es responsable para el cierre final de la brecha epitelial y la restauración de la superficie perturbada1. Realizar heridas artificiales en modelos animales permite la replicación de este complejo proceso en cerca de condiciones fisiológicas2. Sin embargo, este enfoque resulta a menudo en procedimientos experimentales costosos y complicados, que potencialmente carecen de precisión para el estudio de procesos distintos, debido a la intrincada naturaleza del proceso de cicatrización.
Cultivo in vitro de líneas celulares epiteliales proporciona una útil alternativa a modelos animales para investigar el papel que juegan estas células en la cicatrización de la herida y los efectos del tratamiento sobre el comportamiento migratorio de la célula. La fisiología de las células epiteliales a menudo se estudiados por técnicas moleculares con las culturas no-confluentes3,4,5,6; sin embargo, la interrupción de la integridad del epitelio generalmente se logra mediante finas incisiones mecánicas. En cultivo celular, esto implica que una cantidad insignificante de células puede estar expuesta a la brecha de la herida, y representan una muestra demasiado pequeña para técnicas de biología molecular. Sin embargo, estas lesiones pueden estudiarse a escala microscópica, aprovechando las propiedades migratorias innatas de algunas líneas de células epiteliales, como la célula epitelial de pulmón de visón (Mv1Lu) o el celular de queratinocitos humanos espontáneamente inmortalizadas (HaCaT) líneas.
Aquí describimos un método para microscopía que es conveniente obtener datos cuantitativos sobre la migración de células epiteliales en el contexto de3,4,7,8de cicatrización. Por otra parte, se presentan métodos adicionales que son útiles para estudiar los cambios cualitativamente moleculares y morfológicos que se producen en monocapas epiteliales durante la migración. En general, estos métodos proporcionan un marco para estudiar la dinámica y cambios morfológicos con el comportamiento de la célula epitelial y la respuesta a tratamientos durante la cicatrización de heridas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sobre la piel o membrana mucosa de la interrupción, se restaura la función barrera por las acciones de numerosos tipos celulares, incluyendo fibroblastos o células epiteliales e inmunes. Conjuntamente, estas células se someten a un complejo proceso que involucra la apoptosis, proliferación, diferenciación e importante, fibroblastos y epitelial celular la migración, que es el último mecanismo responsable de la restauración del tejido interrumpido y la cierre de la brecha epitelial superficial1</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Queremos dar las gracias a los miembros más antiguos de laboratorio que ayudan a mejorar y perfeccionar estas técnicas a su estado actual: Dr. Celia Martinez-Mora; Dr. Anna Mrowiec, Dr. Catalina Ruiz-Cañada y Dr. Antonia Alcaraz García. Estamos agradecidos al Hospital Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca para apoyar fuertemente el desarrollo de estas técnicas. También el Instituto de Salud Carlos III, Fondo de Investigaciones Sanitarias. Plan Estatal I + D + I y el Instituto de Salud Carlos III-Subdirección General de Evaluación y Fomento de la Investigación (beca Nº: PI13/00794); www.isciii.es. Fondos FEDER “Una manera de hacer Europa”. También agradecemos a Universidad de Murcia, IMIB-Arrixaca y FFIS para asistencia y apoyo administrativo. Por último, queremos dar un agradecimiento especial a Dr. Isabel Martínez-Argudo y la Facultad de Ciencias Ambientales y Bioquímica, Campus Tecnológico de la Fábrica de Armas, Universidad de Castilla-la Mancha, Toledo por su apoyo en ceder voluntariamente el Biomedicina y biotecnología laboratorio para hacer posible la parte filmada de este documento.
Materials
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Biowest, Nuaillé, France | L0102-500 | Optional 10 % FBS supplement |
| Eagles’s Minimum Essential Medium (EMEM) | Lonza | BE12 -662F | Optional 10 % FBS supplement |
| L-Glutamine | Lonza | BE17-605E | Use at 2 mM |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA | DE17603A | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | T4049 | Dilute as appropriate |
| Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | P9155 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (10x) | Gibco by Life Technologies | 14200-067 | Dilute to 1x |
| 24-well culture plates | BD FALCON//SARSTED | 734-0020 | |
| 6-well culture plates | SARSTEDT | 83-3920 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | E9644 | Used 10 ng/mL |
| Round cover glass | MENZEL-GLÄSER | MENZCB00120RA020 | SHORT DEPTH OF FIELD |
| Reinforced razor blade no. 743 | Martor (through VWR) | MARO743.50 | |
| 200 µl sterile aerosol pipet tips | VWR | 732-0541 | |
| 20 µl sterile aerosol pipet tips | VWR | 732-0528 | |
| Digital camera coupled phase contrast microscope | Motic Spain | Moticam camera 2300 3.0 M Pixel USB 2.0; Motic Optic AE31 | |
| Confocal microscope | ZEISS Microimaging, Germany | LSM 510 META | |
| 10 cm Culture dish | BD FALCON | 353003 | |
| Rabbit polyclonal anti c-Jun antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-1694 | Used 1:100 |
| Anti-rabbit IgG (polyclonal goat ) AF 488 | Invitrogen | A11008 | Used 1:400 |
| Hoechst-33258 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | 14530 | Used 1:1000 |
| Alexa Fluor 594 phalloidin (in methanol) (red) | Invitrogen | A12381 | Used 1:100 |
| Bovine Serum Albumin | Santa Cruz Biotechnology | SC-2323 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | T9284 | |
| Skim milk | BD DIFCO | 232100 | |
| ImageJ | National Institutes of Health, USA | Release 1.50i | |
| Zen LSM 510 image processing software | ZEISS Microimaging, Germany | Release 5.0 SP 1.1 |
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