Experimenteel protocol voor het opsporen van mitochondriale functie in Hepatocyten Blootgesteld aan Organochloor pesticiden
Summary
Inzicht in de invloed van milieuorganochloorbestrijdingsmiddelen (OCPs) op de mitochondriale functie bij hepatocyten is belangrijk bij het verkennen van het mechanisme van OCPs die stofwisselingsstoornissen veroorzaken. Dit document presenteert gedetailleerde methoden voor het opsporen van levermitaire functie.
Abstract
Dit document presenteert gedetailleerde methoden voor het opsporen van levermitaire functie voor een beter begrip van de oorzaak van metabole aandoeningen veroorzaakt door milieuorganochloor pesticiden (OCPs) in hepatocyten. HepG2-cellen werden gedurende 24 uur blootgesteld aan β-hexachloormohexaan (β-HCH) bij een equivalente dosis interne blootstelling in de algemene populatie. Ultrastructuur in hepatocyten werd onderzocht door transmissie elektronenmicroscopie (TEM) om de schade van mitochondriën aan te tonen. Mitochondriale functie werd verder geëvalueerd door mitochondriale fluorescentieintensiteit, adenosine 5′-triphosfat (ATP) niveaus, zuurstofverbruik (OCR) en mitochondriaal membraan potentieel (MMP) in HepG2 cellen geïncubeerd met β-HCH. De mitochondriën fluorescentie intensiteit na gekleurd door mitochondriale groene fluorescerende sonde werd waargenomen met een fluorescentie microscopie. De luciferin-luciferase reactie werd gebruikt om atp niveaus te bepalen. De MMP werd gedetecteerd door de kationische kleurstof JC-1 en geanalyseerd onder stroom cytometrie. OCR werd gemeten met een extracellulaire flux analyzer. Samengevat, deze protocollen werden gebruikt bij het opsporen van mitochondriale functie in hepatocyten met mitochondriën schade te onderzoeken.
Introduction
De effecten van organochloorbestrijdingsmiddelen (OCP’s) op de gezondheid, zoals reproductieve interferentie, immunologische toxiciteit, metabolische veranderingen zijn eerder onderzocht1,2,3. De methoden om cellulaire metabolisme te detecteren en erachter te komen mitochondriale disfunctie hebben wetenschappers in staat gesteld om de rol van mitochondriale functie te begrijpen (d.w.z., mitochondriale STAT3-niveaus, lactaat, pyruvaat, lactaat-naar-pyruvaatverhouding, co-enzym Q10, mitochondriaal protonlek, bio-energetiek, biogenese en dynamica) op gebieden zoals veroudering, obesitas, diabetes, cardiovasculaire functie, kanker en veiligheidstoxiciteit4,,5,,6,7. In dit artikel beschrijven we de methoden voor het beoordelen van mitochondriale disfunctie veroorzaakt door OCPs.
We stelden HepG2-cellen bloot aan β-hexachloormohexaan (β-HCH), een representatieve OCP’s, voor 24 uur bij een dosis die gelijk is aan interne blootstelling van de mens. Ten eerste werd TEM toegepast om de ultrastructuur van hepatocyten te observeren, zoals kernen, mitochondriën en endoplasmatisch reticulum8. Vergeleken met gewone microscopen maakt TEM het mogelijk om de 2D en 3D ultrastructuur van cellen en celcomponenten (cellijnen of weefsel), de morfologie, chemische samenstelling en functie van natuurlijke of kunstmatige materialen die een centrale rol spelen in de moderne wetenschap en technologie te verkennen. Mitochondriale functie werd verder geëvalueerd door mitochondriale fluorescentie intensiteit, adenosine 5′-triphosfat (ATP) niveaus, zuurstofverbruik (OCR) en mitochondriaal membraan potentieel (MMP)in HepG2 cellen geïncubeerd met β-HCH. Mito-tracker groen is een mitochondriën groene fluorescerende sonde die kan worden gebruikt voor levende cel mitochondriaal-specifieke fluorescerende vlekken. De mitochondriën in hepatocyten werden gekleurd door mito-tracker groene oplossing en mitochondriale fluorescentie intensiteit, aantal en patroon werden waargenomen met een confocale microscopie9. Mitochondriale groene fluorescerende sonde kan worden gebruikt om levende cellen te bevlekken. Vergeleken met rhodamine 123 of JC-1 is mitochondriaal groene fluorescerende sonde niet afhankelijk van mitochondriaal membraanpotentieel voor mitochondriale vlekken. ATP-niveaus werden bepaald door een luciferase-luciferin kit en genormaliseerd door eiwitconcentratie. ATP-testkit kan worden gebruikt om ATP-niveaus te detecteren in gemeenschappelijke oplossingen, cellen of weefsels. Deze kit is gebaseerd op firefly luciferase gekatalyseerd door fluoresceïne om fluorescentie te genereren, wanneer ATP nodig is om energie te leveren. Wanneer de vuurvlieg luciferase en fluoresceïne buitensporig zijn, is de generatie van fluorescentie evenredig met de concentratie van ATP. Daarnaast is deze kit speciaal ontworpen om de chemiluminescentie van ATP te optimaliseren. ATP, als de belangrijkste energiemoleculen, speelt een belangrijke rol in de verschillende fysiologische of pathologische processen van cellen. Veranderingen in ATP-niveaus kunnen defecten in de celfunctie weerspiegelen, met name de productie van mitochondriale energie. Meestal onder apoptose, necrose of in een giftige toestand, cellulaire ATP niveaus verminderd 10. MMP’s test kit met JC-1 is een kit die JC-1 gebruikt als een fluorescerende sonde om cellen, weefsels of gezuiverde MMP’s snel en gevoelig te detecteren. Het kan worden gebruikt voor vroegtijdige opsporing van apoptose. De kationische kleurstof JC-1 is een fluorescerende sonde die wordt gebruikt om de MMP die kan worden geanalyseerd onder stroom cytometrie aangegeven door veranderingen van groene en rode fluorescentie verhouding te detecteren. Wanneer het MMP hoog is, wordt JC-1 samengevoegd in de matrix van de mitochondriën tot een polymeer (J-aggregaten), dat rode fluorescentie produceert. Wanneer het MMP laag is, kan JC-1 zich niet ophopen en vormt monomeer die groene fluorescentieproduceert 11. Dus de verhouding van rode en groene fluorescentie kan het niveau van MMP weerspiegelen. De OCR van cellen is een cruciale indicator van de normale cellulaire functie12. Het wordt beschouwd als een parameter voor onderzoek mitochondriale functie. Cell mito stress test kit biedt een stabiele methode voor het analyseren van de belangrijkste parameters van mitochondriale functie. De kit biedt kwaliteitscontrole en voorspellende reagentia, evenals een standaardmethode voor het uitvoeren van cel mitochondriale stresstest. Het kan worden gebruikt om alle celtypen te detecteren, inclusief primaire cellen, cellijnen, zwevende cellen, en ook voor eilandjes, aaltjes, gisten en geïsoleerde mitochondriën.
OCR-meting kan waardevol inzicht geven in de fysiologische status of veranderingen van cellen. Het werd bepaald met een extracellulaire flux analyzer om ademhaling baseline, proton lek, maximale luchtwegen, ATP omzet en reserve capaciteit te detecteren. Kortom, na basismetingen van OCR werd OCR gedetecteerd nadat het achtereenvolgens had toegevoegd aan oligomycine (ATP Coupler), FCCP (mitochondriale oxidatieve fosforylatie uncoupler) en antimycine A/rotenone (een remmer van zuurstofverbruik)per put.
In een poging om de ontwikkeling van meer specifiek protocol voor het opsporen van mitochondriale functie in hepatocyten in vitro te vergemakkelijken, presenteren we hier experimenten door TEM, confocale microscopie, luminometer, stroomcytometrie en extracellulaire flux analyzer met toekomstige toepassing bij het bestuderen van mitochondriën schade gerelateerde nadelige resultaten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cruciaal voor het succes van het detectieprotocol is het gebruik van een verscheidenheid aan experimentele methoden die zijn behandeld de studie van fenotype tot mechanisme. In deze studie werden HepG2-cellen gekweekt in DMEM met penicilline en streptomycine en 10% foetaal runderserum. Wanneer cellen 40-50% samenvloeiing bereikten, werden β-HCH (0, 10, 100 ng/mL) toegevoegd en voor 24 uur geïncubeerd. We gebruikten eerst TEM die de ultrastructurele veranderingen in hepatocyte toonde veroorzaakt door de representatieve …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (Grant Nos. 81573174, 81570574); het Uitstaande Jeugdfonds van de provincie Jiangsu (SBK2014010296); het onderzoeksproject van het Chinese ministerie van Onderwijs (213015A); de Priority Academic Program Development van Jiangsu Higher Education Institutions (PAPD), het vlaggenschip van de belangrijkste ontwikkeling van jiangsu instellingen voor hoger onderwijs; en het Open Project Program van het State Key Laboratory of Environmental Chemistry and Ecotoxicology (KF2015-01).
Materials
| Transmission electron microscope | FEI | Tecnai G2 Spirit Bio TWIN | High-contrast, high-resolution imaging, Low-dose observation and imaging, Low-temperature observation, Outstanding analytical performance, Automation for convenience and performance |
| Mito-Tracker Green | Beyotime | C1048 | Mito-Tracker Green is a mitochondrial green fluorescent probe that can be used for live cell mitochondrial-specific fluorescent staining. |
| Laser scanning confocal microscope | Zeiss | 700B | The design is compact, stable, light path is the shortest, high light precision, creative technology and sophisticated scanning technology together to produce a perfect 3-dimensional specimen image. |
| Enhanced ATP Assay Kit | Beyotime | S0027 | Enhanced ATP Assay Kit can be used to detect ATP (adenosine 5'-triphosphate) levels in common solutions, cells or tissues. Cells and tissue samples can be split to complete the sample preparation, detection sensitivity up to 0.1nmol / L, chemiluminescence can be sustained for 30 minutes. |
| Luminometer | Berthold | Centro LB 960 | Luminometer is chemiluminescence detector, the test sample itself can be light, do not need to stimulate. Luminometer is the instrument that detects chemiluminescence. |
| BCA Protein Assay Kit | Beyotime | P0012 | BCA Protein Assay Kit is one of the most commonly used methods for detecting protein concentrations. |
| Multimode reader | TECAN | InfiniteM200 | Multimode reader be used to detect protein consentration. |
References
- Rantakokko, P., et al. Persistent organic pollutants and non-alcoholic fatty liver disease in morbidly obese patients: a cohort study. Environ Health. 14, 79 (2015).
- Mrema, E. J., et al. Persistent organochlorinated pesticides and mechanisms of their toxicity. Toxicology. 307, 74-88 (2013).
- Dirinck, E., et al. Obesity and persistent organic pollutants: possible obesogenic effect of organochlorine pesticides and polychlorinated biphenyls. Obesity (Silver Spring). 19 (4), 709-714 (2011).
- Genini, D., et al. Mitochondrial dysfunction induced by a SH2 domain-targeting STAT3 inhibitor leads to metabolic synthetic lethality in cancer cells. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2017).
- Korovljev, D., Trivic, T., Drid, P., Ostojic, S. M. Molecular hydrogen affects body composition, metabolic profiles, and mitochondrial function in middle-aged overweight women. Ir J Med Sci. , (2017).
- Gonzalez-Franquesa, A., Patti, M. E. Insulin Resistance and Mitochondrial Dysfunction. Adv Exp Med Biol. 982, 465-520 (2017).
- Cheng, J., et al. Mitochondrial Proton Leak Plays a Critical Role in Pathogenesis of Cardiovascular Diseases. Adv Exp Med Biol. 982, 359-370 (2017).
- Cheville, N. F., Stasko, J. Techniques in electron microscopy of animal tissue. Vet Pathol. 51 (1), 28-41 (2014).
- Nazmara, Z., Salehnia, M., HosseinKhani, S. Mitochondrial Distribution and ATP Content of Vitrified, In vitro Matured Mouse Oocytes. Avicenna J Med Biotechnol. 6 (4), 210-217 (2014).
- Clapier, C. R., Iwasa, J., Cairns, B. R., Peterson, C. L. Mechanisms of action and regulation of ATP-dependent chromatin-remodelling complexes. Nat Rev Mol Cell Biol. , (2017).
- Reitman, Z. J., et al. Cancer-associated isocitrate dehydrogenase 1 (IDH1) R132H mutation and d-2-hydroxyglutarate stimulate glutamine metabolism under hypoxia. J Biol Chem. 289 (34), 23318-23328 (2014).
- Nelson, J. A. Oxygen consumption rate v. rate of energy utilization of fishes: a comparison and brief history of the two measurements. J Fish Biol. 88 (1), 10-25 (2016).
- Liu, Q., et al. Organochloride pesticides impaired mitochondrial function in hepatocytes and aggravated disorders of fatty acid metabolism. Sci Rep. 7, 46339 (2017).
- Tien, T., et al. High Glucose Induces Mitochondrial Dysfunction in Retinal Muller Cells: Implications for Diabetic Retinopathy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (7), 2915-2921 (2017).
- Dussmann, H., Perez-Alvarez, S., Anilkumar, U., Papkovsky, D. B., Prehn, J. H. Single-cell time-lapse imaging of intracellular O2 in response to metabolic inhibition and mitochondrial cytochrome-c release. Cell Death Dis. 8 (6), 2853 (2017).
- Jaiswal, M. K. Riluzole But Not Melatonin Ameliorates Acute Motor Neuron Degeneration and Moderately Inhibits SOD1-Mediated Excitotoxicity Induced Disrupted Mitochondrial Ca2+ Signaling in Amyotrophic Lateral Sclerosis. Front Cell Neurosci. 10, 295 (2016).
- Song, E., et al. Lenti-siRNA Hsp60 promote bax in mitochondria and induces apoptosis during heat stress. Biochem Biophys Res Commun. 481 (1-2), 125-131 (2016).
- Li, Y., et al. Tea tree oil exhibits antifungal activity against Botrytis cinerea by affecting mitochondria. Food Chem. 234, 62-67 (2017).
- Grunig, D., Felser, A., Bouitbir, J., Krahenbuhl, S. The catechol-O-methyltransferase inhibitors tolcapone and entacapone uncouple and inhibit the mitochondrial respiratory chain in HepaRG cells. Toxicol In Vitro. 42, 337-347 (2017).
- Mayor, F., et al. G protein-coupled receptor kinase 2 (GRK2) as an integrative signalling node in the regulation of cardiovascular function and metabolic homeostasis. Cell Signal. , (2017).
- Clark, A., Mach, N. The Crosstalk between the Gut Microbiota and Mitochondria during Exercise. Front Physiol. 8, 319 (2017).
- Robicsek, O., et al. Isolated Mitochondria Transfer Improves Neuronal Differentiation of Schizophrenia-Derived Induced Pluripotent Stem Cells and Rescues Deficits in a Rat Model of the Disorder. Schizophr Bull. , (2017).
- Akinrotimi, O., et al. Shp deletion prevents hepatic steatosis and when combined with Fxr loss protects against type 2 diabetes. Hepatology. , (2017).
- Rosa, A. I., et al. Novel insights into the antioxidant role of tauroursodeoxycholic acid in experimental models of Parkinson’s disease. Biochim Biophys Acta. , (2017).
- Matondo, A., Kim, S. S. Targeted-Mitochondria Antioxidants Therapeutic Implications in Inflammatory Bowel Disease. J Drug Target. , 1-30 (2017).
