À l’aide de hybridation In Situ par Fluorescence (FISH) pour surveiller l’état des bras cohésion en prométaphase et métaphase j’ai Drosophila ovocytes
Summary
Ce manuscrit présente une méthode détaillée pour la génération X-sondes de bras de chromosome et performants fluorescence in situ hybridation (poisson) pour examiner l’état de sœur cohésion des chromatides sœurs en prométaphase et métaphase que j’ai arrêté Drosophile ovocytes. Ce protocole est convenable pour déterminer si la cohésion bras méiotique est intacte ou perturbé dans différents génotypes.
Abstract
Chez l’homme, erreurs de ségrégation chromosomique dans les ovocytes sont responsables de la majorité des avortements et des malformations congénitales. En outre, comme l’âge des femmes, leur risque de concevoir qu’un fœtus aneuploïde augmente considérablement et ce phénomène est connu comme l’effet de l’âge de la mère. Une condition requise pour la ségrégation des chromosomes précis pendant les divisions méiotiques est entretien de sœur cohésion des chromatides sœurs pendant la période prolongée de la prophase que rencontrer des ovocytes. Cytologiques chez les humains et les organismes modèles suggèrent que la cohésion méiotique se détériore au cours du processus de vieillissement. En outre, des erreurs de ségrégation dans des ovocytes humains sont les plus répandus au cours de la méiose I, compatibles avec une perte prématurée de la cohésion des bras. L’utilisation d’organismes modèles est critique pour démêler les mécanismes qui sous-tendent la perte de fonction de l’âge de la cohésion. Drosophila melanogaster offre plusieurs avantages pour l’étude de la régulation de la méiose cohésion dans les ovocytes. Toutefois, jusqu’à tout récemment, seuls les tests génétiques étaient disponibles pour dosage pour la perte de cohésion du bras dans les ovocytes de génotypes différents ou dans des conditions expérimentales différentes. Ici, un protocole détaillé est fourni fluorescence in situ de l’hybridation (poisson) pour visualiser directement les défauts cohésion bras en prométaphase I et métaphase que j’ai arrêté les ovocytes de drosophile . En générant une sonde de poissons qui s’hybride au bras distal du chromosome X et la collecte des piles de Z confocale, un chercheur peut visualiser le nombre de signaux individuels de poissons en trois dimensions et déterminer si sœur chromatid bras sont séparés. La procédure décrite permet de quantifier les défauts cohésion bras dans des centaines d’ovocytes de drosophile . Par conséquent, cette méthode fournit un outil important pour étudier les mécanismes qui contribuent au maintien de la cohésion ainsi que les facteurs qui conduisent à sa disparition pendant le processus de vieillissement.
Introduction
La séparation des chromosomes pendant la mitose et la méiose exige que sœur cohésion des chromatides sœurs être créée, maintenue et publiée dans une manière coordonnée1,2. Cohésion est établie au cours de la phase S et est véhiculée par la cohesin complexe, qui forme des liens physiques qui maintiennent la sœur chromatides ensemble. Lors de la méiose, distal par rapport à un crossover de cohésion peut également sert à tenir ensemble les homologues de recombinaison et cette association physique contribue à l’orientation correcte du bivalent sur la métaphase I de broche (Figure 1)3,4, 5. Sortie du bras de cohésion à l’anaphase I permet les homologues de séparer vers les pôles opposés de broche. Toutefois, si la cohésion du bras est perdu prématurément, recombinés homologues seront perdent leur connexion physique et séparer aléatoirement, qui peut entraîner des gamètes aneuploïdes (Figure 1).
Dans les ovocytes humains, erreurs dans la ségrégation des chromosomes sont la principale cause des avortements et des malformations congénitales, comme le Syndrome de Down6, et leur incidence augmente de façon exponentielle avec l’âge maternel7. Cohésion des chromatides est établie dans les ovocytes fœtales et la recombinaison méiotique est terminée avant la naissance. Ovocytes puis arrêter au milieu de la prophase I jusqu’à l’ovulation et au cours de cette arrestation, l’association physique continue de recombinés homologues repose sur sœur cohésion des chromatides sœurs. Par conséquent, ségrégation précise au cours de la méiose et de la grossesse normale exige que cohésion reste intact pendant jusqu’à cinq décennies.
La perte prématurée de cohésion lors de l’arrestation de méiose prolongée d’ovocytes humains a été proposée de contribuer à l’effet de l’âge maternel et plusieurs lignes d’éléments de preuve appuient cette hypothèse8,9. Toutefois, compte tenu des difficultés de l’étude méiotique cohésion dans des ovocytes humains, une grande partie de notre compréhension de ce phénomène repose sur l’utilisation du modèle organismes5,10,11,12, 13,14,15.
Drosophila melanogaster ovocytes offrent de nombreux avantages pour l’étude de la ségrégation méiotique de cohésion et du chromosome. Un simple test génétique permet de récupérer des descendants de gamètes aneuploïdes et mesurer la fidélité de X-ségrégation des chromosomes sur une grande échelle11,16,17. En outre, on peut également déterminer si erreurs de ségrégation chromosomique proviennent du fait que la recombinés homologues missegregate au cours de la méiose I, un phénotype qui correspond à une perte prématurée de bras cohésion11,18, 19. direct observation de l’état de la méiose cohésion dans les ovocytes de la drosophile est également possible en utilisant l’hybridation in situ par fluorescence (FISH). Bien que les oligonucléotides fluorescents qui s’hybrident aux séquences répétitives par satellite ont été utilisés pour plus d’une décennie pour surveiller la cohésion péricentromérique mature Drosophila ovocytes4,20, analyse du bras la cohésion a été beaucoup plus difficile. Visualisation de l’état de la cohésion des bras nécessite une sonde qui s’étend sur une vaste région de l’exemplaire unique sequences et est assez brillante pour se traduire par des signaux visibles pour chaque sœur chromatides bras cohésion est absente. En outre, les conditions de fixation des ovocytes et la taille de l’ADN marqués doivent faciliter la pénétration21 dans l’ovocyte de drosophile mature gros (200 µm de largeur de 500 µm de longueur). Récemment, une sonde de bras a été avec succès utilisés pour visualiser les chromatides ovocyte de drosophile au cours de l’anaphase I, mais les auteurs a déclaré qu’ils ne pouvaient pas détecter un signal en prométaphase ou métaphase que j’ai arrêté les ovocytes22. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour la génération de X-bras chromosomique poisson des sondes et des conditions de préparation des ovocytes qui nous ont permis d’analyser pour une perte prématurée de la soeur de cohésion des chromatides sœurs en prométaphase I et métaphase I ovocytes. Ces techniques, qui nous ont permis d’identifier les produits des gènes qui sont requises pour le maintien de la cohésion méiotique, permettra à d’autres d’analyser pour sœur ovocytes matures de drosophile de génotypes différents vices de cohésion des chromatides sœurs.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’utilisation de poissons sondes pour évaluer l’état de la cohésion des bras en prométaphase I et métaphase j’ai Drosophila ovocytes est un progrès considérable dans le domaine de la méiose de drosophile . Historiquement, les chercheurs de la drosophile ont été limités aux tests génétiques pour déduire une perte prématurée de la cohésion de bras dans les ovocytes matures11,18,19….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par les NIH Grant GM59354 attribué à Sharon E. Bickel. Nous remercions Huy Nguyen Q. aide à l’élaboration du protocole pour la production de sondes fluorescentes bras, Ann Lavanway de l’aide avec la microscopie confocale et J. Emiliano Reed pour l’assistance technique. Nous remercions également les nombreux collègues dans la communauté de drosophile pour discussions utiles et des conseils.
Materials
| Kits | |||
| Midi Prep kit | Qiagen | 12143 | Prep BAC clone DNA |
| GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit | Sigma | WGA2 | Amplify BAC clone DNA |
| ARES Alexa Fluor 647 DNA labeling kit | Invitrogen | A21676 | Label BAC clone DNA |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 | Remove non-conjugated dye following labeling of BAC clone DNA |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals & Solutions | |||
| Note: All solutions are prepared using sterile ultrapure water and should be sterilized either by autoclave or filter sterilization. | |||
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-100 | Prepare 10% stock Freeze aliquots |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | C75-500 | |
| DAPI (4’, 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | Toxic: wear appropriate protection. Prepare 100µg/ml stock in 100% ethanol, store in aliquots at -20 °C. Prepare 1 µg/ml solution in 2X SSCT before use. |
| Dextran sulfate | Sigma | D-8906 | |
| Drierite | Drierite Company | 23001 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Invitrogen | 15508-013 | Prepare 10 mM stock |
| dTTP (10 µmol, 100 µl) | Boehringer Mannheim | 1277049 | Prepare 1 mM stock |
| EDTA (Disodium ethylenediamine tetraacetic acid) | Fisher Scientific | S311-500 | Prepare 250 mM stock |
| 100% ethanol (molecular grade, 200 proof) | Decon Laboratories | 2716 | |
| Tris (Ultra Pure) | Invitrogen | 15504-020 | |
| EGTA (Ethylenebis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid) | Sigma | E-3889 | |
| 16% formaldehyde | Ted Pella, Inc. | 18505 | Toxic: wear appropriate protection |
| Formamide | Invitrogen | AM9342 | Toxic: wear appropriate protection |
| Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Glycogen | Roche | 901393 | |
| HEPES | Boehringer Mannheim | 737-151 | |
| Heptane | Fisher Scientific | H350-4 | Toxic: wear appropriate protection. |
| Hydrochloric acid | Millipore | HX0603-4 | Toxic: wear appropriate protection. |
| Hydroxylamine | Sigma | 438227 | Prepare 3 M stock |
| 4.9 M Magnesium chloride | Sigma | 104-20 | |
| Na2HPO4 Ÿ 7H2O | Fisher Scientific | S373-500 | |
| NaH2PO4 Ÿ 2H2O | Fisher Scientific | S369-500 | |
| Poly-L-lysine (0.1mg/ml) | Sigma | P8920-100 | |
| Potassium acetate | Fisher Scientific | BP364-500 | |
| Sodium acetate | Fisher Scientific | S209-500 | Prepare 3M stock |
| Sodium cacodylate | Polysciences, Inc. | 1131 | Toxic: wear appropriate protection. Prepare 400mM stock |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | BP327-1 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-3 | Sodium chloride |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| 10% Tween 20 | Thermo Scientific | 28320 | Surfact-Amps |
| 10% Triton X-100 | Thermo Scientific | 28314 | Surfact-Amps |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| Note: All solutions are prepared using sterile ultrapure water and should be sterilized either by autoclave or filter sterilization. | |||
| TE buffer | 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH = 8.0 | ||
| 20X SSC (Saline Sodium Citrate) | 3 M NaCl, 300 mM sodium citrate | ||
| 2X cacodylate fix solution | Toxic: wear appropriate protection. 200 mM sodium cacodylate, 200 mM sucrose, 80 mM sodium acetate, 20 mM EGTA | ||
| 1.1X Hybridization buffer | 3.3X SSC, 55% formamide, 11% dextran sulfate | ||
| Fix solution | Toxic: wear appropriate protection. 4% formaldehyde, 1X cacodylate fix solution | ||
| PBSBTx | 1X PBS, 0.5% BSA, 0.1% Trition X-100 | ||
| PBSTx | 1X PBS, 1% Trition X-100 | ||
| Extraction buffer (PBSTx + Rnase) | 1X PBS, 1% Trition X-100, 100 µg/mL RNase | ||
| 2X SSCT | 2X SSC, 0.1% Tween 20 | ||
| 2X SSCT + 20% formamide | Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 20% formamide | ||
| 2X SSCT + 40% formamide | Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 40% formamide | ||
| 2X SSCT + 50% formamide | Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 50% formamide | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Enzymes | |||
| AluI | New England Biolabs | R0137S | |
| HaeIII | New England Biolabs | R0108S | |
| MseI | New England Biolabs | R0525S | |
| MspI | New England Biolabs | R0106S | |
| RsaI | New England Biolabs | R0167S | |
| BfuCI | New England Biolabs | R0636S | |
| 100X BSA | New England Biolabs | Comes with NEB enzymes | |
| 10X NEB buffer #2 | New England Biolabs | Restriction enzyme digestion buffer. Comes with NEB enzymes | |
| Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) 400 U/µl | Roche/Sigma | 3333566001 | |
| TdT buffer | Roche/Sigma | Comes with TdT enzyme | |
| Cobalt chloride | Roche/Sigma | Toxic: wear appropriate protection. Comes with TdT enzyme | |
| RNase A (10 mg/mL) | Thermo-Scientific | EN0531 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytology Tools etc. | |||
| Forceps | Dumont | #5 INOX, Biologie | |
| 9” Disposable glass Pasteur pipettes | Fisher | 13-678-20C | Autoclave to sterilize |
| Shallow glass dissecting dish | Custom made | ||
| Deep well dish (3 wells) | Pyrex | 7223-34 | |
| Fisherfinest Premium microscope slides | Fisher Scientific | 22-038-104 | Used to cover deep well dishes |
| Frosted glass slides, 25 x 75 mm | VWR Scientific | 48312-002 | |
| Glass slides, 3 x 1 in, 1 mm thick | Thermo-Scientific | 3051 | |
| Coverslips, 10 x 10 mm, No. 1.5 | Thermo-Scientific | 3405 | |
| Tungsten needle | homemade | ||
| Prolong GOLD mounting media | Molecular Probes | P36930 | |
| Compressed-air in can | Various | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| PCR machine | Various | ||
| Nanodrop 2000, spectrophotometer | Thermo-Scientific | microvolume spectrophotometer | |
| Vortexer | Various | ||
| Table top microfuge at room temperature | Various | ||
| Table top microfuge at 4 °C | Various | ||
| Heat block | Various | ||
| Hybridization oven or incubator with rotator | Various | ||
| Nutator | Various | ||
| A1RSi laser scanning confoal | Nikon | 40X oil Plan Fluor DIC (NA 1.3) | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables etc. | |||
| 50 mL conical tubes | Various | ||
| 15 mL conical tubes | Various | ||
| 1.5 mL microfuge tubes | Various | ||
| 500 µl microfuge tubes | Various | ||
| 200 µl PCR tubes | Various | ||
| Plastic container with tight fitting lid | Various | To hold Drierite | |
| Kimwipes | Various | disposable wipes | |
| Parafilm | Various | paraffin film | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 기타 | |||
| HPLC purified 5'-labeled oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | Cy3-labeled probes that recognize the 359 bp satellite repeat of the X chromosome | |
| Volocity 3D Image Analysis Software | PerkinElmer | Version 6.3 |
References
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