Uso de hibridização in situ de fluorescência (FISH) para monitorar o estado da coesão do braço em oócitos de Drosophila na prometáfase e na metáfase I
Summary
Este manuscrito apresenta um método detalhado para a geração X-cromossomo braço sondas e realizando fluorescência situ hibridação in (peixe) para examinar o estado da irmã coesão cromátide em prometafase e metáfase prendi Drosófila ovócitos. Este protocolo é apropriado para determinar se a coesão de braço meiótica é intacta ou interrompidos em diferentes genótipos.
Abstract
Em humanos, erros de segregação do cromossomo em oócitos são responsáveis para a maioria dos abortos espontâneos e malformações congénitas. Além disso, como as mulheres envelhecem, o risco de conceber que um feto aneuploid aumenta dramaticamente e este fenómeno é conhecido como o efeito da idade materna. Um requisito para a segregação do cromossomo precisos durante as divisões meióticas é manutenção da irmã coesão de cromátides irmãs durante o período de prófase estendida que a experiência de oócitos. Citológicas em seres humanos e organismos modelo sugerem que a coesão meiótica deteriora-se durante o processo de envelhecimento. Além disso, erros de segregação em oócitos humanos são mais prevalentes durante a meiose I, consistente com a perda prematura da coesão do braço. O uso de organismos modelo é fundamental para desvendar os mecanismos subjacentes a idade-dependente perda de coesão. Drosophila melanogaster oferece diversas vantagens para estudar o Regulamento de coesão meiótica em oócitos. No entanto, até recentemente, apenas testes genéticos estavam disponíveis a ensaiar para a perda de coesão de braço em oócitos de genótipos diferentes ou em diferentes condições experimentais. Aqui, um protocolo detalhado é fornecido usando fluorescência em situ hibridação (peixe) para visualizar diretamente os defeitos na coesão de braço em prometafase I e metáfase prendi Drosophila oócitos. Gerando uma sonda de peixe que se para o braço distal do cromossomo X e coletando pilhas de Z confocal, um pesquisador pode visualizar o número de sinais individuais de peixes em três dimensões e determinar se irmã cromátide braços são separados. O procedimento descrito torna possível quantificar defeitos de coesão braço em centenas de oócitos de Drosophila . Como tal, este método oferece uma importante ferramenta para investigar os mecanismos que contribuem para a manutenção da coesão, bem como os fatores que levam à sua extinção durante o processo de envelhecimento.
Introduction
Adequada segregação dos cromossomos durante a mitose e meiose exige que a irmã cromátide coesão ser estabelecido, mantido e lançado em uma coordenada1,2. Coesão é estabelecida durante a fase S e é mediada pelo cohesin complexo, que forma ligações físicas que segure a irmã cromátides irmãs juntos. Na meiose, coesão distal de um crossover também funções para armazenar recombinantes homologs juntos e esta associação física ajuda a garantir a adequada orientação do forma bivalente na metáfase eu do eixo (Figura 1)3,4, 5. Lançamento do braço coesão na anáfase permite-lhe as homologs segregar para polos opostos do fuso. No entanto, se a coesão do braço é perdido prematuramente, recombinantes homologs perderá sua conexão física e segregar aleatoriamente, que pode resultar em gâmetas aneuploid (Figura 1).
Em oócitos humanos, erros na segregação do cromossomo são a principal causa de abortos e defeitos de nascimento, como síndrome de Down,6, e sua incidência aumenta exponencialmente com a idade materna7. Coesão de cromatídeos é criada em oócitos fetais e recombinação meiótica é concluída antes do nascimento. Oócitos depois prenda no meio da prófase eu até ovulação e durante esta prisão, associação física continuada de recombinantes homologs baseia-se na irmã coesão de cromátides irmãs. Portanto, precisa segregação durante a meiose e os resultados de gravidez normal exigem que coesão permanecem intactas por até cinco décadas.
Perda prematura de coesão durante a prolongada detenção meiótica de oócitos humanos tem sido proposta para contribuir para o efeito da idade materna e várias linhas de evidência suportam esta hipótese8,9. No entanto, tendo em conta os desafios da coesão meiótica em oócitos humanos a estudar, muito da nossa compreensão deste fenômeno baseia-se sobre a utilização do modelo organismos5,10,11,12, 13de14,,15.
Drosophila melanogaster oócitos oferecem inúmeras vantagens para o estudo da segregação meiótica de coesão e cromossomo. Um ensaio simples genético permite recuperar a descendência dos gâmetas aneuploid e medir a fidelidade do X-segregação de cromossomos em uma grande escala11,16,17. Além disso, um pode também determinar se erros de segregação do cromossomo surgem porque homologs recombinantes missegregate durante a meiose I, um fenótipo que é consistente com a perda prematura de braço coesão11,18, 19. direta observação do estado de coesão meiótica em oócitos de Drosophila também é possível usar a fluorescência em situ da hibridação (peixe). Apesar de oligonucleotídeos fluorescentes que hibridizam às sequências repetitivas de satélite têm sido usados por mais de uma década para monitorar pericentromeric coesão em madura Drosophila oócitos4,20, análise de braço coesão tem sido muito mais desafiador. Visualização do estado de coesão braço requer uma sonda que se estende por uma grande região de cópia única sequências e é brilhante o suficiente para resultar em sinais visíveis para cada irmã cromátides irmãs quando braço coesão está ausente. Além disso, as condições de fixação do oócito e tamanho dos DNAs rotuladas devem facilitar a penetração21 para o grande oócito maduro de Drosophila (200 µm de largura por 500 µm de comprimento). Recentemente, uma sonda de braço com êxito foi utilizado Visualizar cromátides irmãs oócito de Drosophila durante a anáfase, eu, mas os autores afirmou que não podia detectar um sinal em prometafase ou metáfase prendi oócitos22. Aqui nós fornecemos um protocolo detalhado para a geração de X-braço do cromossoma sondas de peixe e as condições de preparação de oócito que nos permitiram a ensaiar para a perda prematura da irmã coesão cromátide em prometafase I e metáfase eu oócitos. Estas técnicas, que nos permitiram identificar produtos de genes que são necessários para a manutenção da coesão meiótica, permitirá que outros a ensaiar para a irmã coesão cromátide defeitos em oócitos maduros de drosófila de diferentes genótipos.
Protocol
Representative Results
Discussion
O uso de peixes sondas para avaliar o estado da coesão de braço em prometafase I e metáfase eu Drosophila oócitos é um avanço significativo no campo da drosófila meiose. Historicamente, a drosófila pesquisadores foram limitados ao testes genéticos para inferir a perda prematura da coesão de braço em oócitos maduros11,18,19. Agora, com os métodos apresentados aqui, o estado da coesão do br…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo NIH Grant GM59354 atribuído a Sharon E. Bickel. Agradecemos Huy p. Nguyen assistência no desenvolvimento do protocolo para a geração de sondas fluorescentes braço, Ann Lavanway para ajuda com microscopia confocal e J. Emiliano Reed para assistência técnica. Agradecemos também a numerosos colegas na Comunidade da drosófila para discussões úteis e conselhos.
Materials
| Kits | |||
| Midi Prep kit | Qiagen | 12143 | Prep BAC clone DNA |
| GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit | Sigma | WGA2 | Amplify BAC clone DNA |
| ARES Alexa Fluor 647 DNA labeling kit | Invitrogen | A21676 | Label BAC clone DNA |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 | Remove non-conjugated dye following labeling of BAC clone DNA |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals & Solutions | |||
| Note: All solutions are prepared using sterile ultrapure water and should be sterilized either by autoclave or filter sterilization. | |||
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-100 | Prepare 10% stock Freeze aliquots |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | C75-500 | |
| DAPI (4’, 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | Toxic: wear appropriate protection. Prepare 100µg/ml stock in 100% ethanol, store in aliquots at -20 °C. Prepare 1 µg/ml solution in 2X SSCT before use. |
| Dextran sulfate | Sigma | D-8906 | |
| Drierite | Drierite Company | 23001 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Invitrogen | 15508-013 | Prepare 10 mM stock |
| dTTP (10 µmol, 100 µl) | Boehringer Mannheim | 1277049 | Prepare 1 mM stock |
| EDTA (Disodium ethylenediamine tetraacetic acid) | Fisher Scientific | S311-500 | Prepare 250 mM stock |
| 100% ethanol (molecular grade, 200 proof) | Decon Laboratories | 2716 | |
| Tris (Ultra Pure) | Invitrogen | 15504-020 | |
| EGTA (Ethylenebis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid) | Sigma | E-3889 | |
| 16% formaldehyde | Ted Pella, Inc. | 18505 | Toxic: wear appropriate protection |
| Formamide | Invitrogen | AM9342 | Toxic: wear appropriate protection |
| Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Glycogen | Roche | 901393 | |
| HEPES | Boehringer Mannheim | 737-151 | |
| Heptane | Fisher Scientific | H350-4 | Toxic: wear appropriate protection. |
| Hydrochloric acid | Millipore | HX0603-4 | Toxic: wear appropriate protection. |
| Hydroxylamine | Sigma | 438227 | Prepare 3 M stock |
| 4.9 M Magnesium chloride | Sigma | 104-20 | |
| Na2HPO4 Ÿ 7H2O | Fisher Scientific | S373-500 | |
| NaH2PO4 Ÿ 2H2O | Fisher Scientific | S369-500 | |
| Poly-L-lysine (0.1mg/ml) | Sigma | P8920-100 | |
| Potassium acetate | Fisher Scientific | BP364-500 | |
| Sodium acetate | Fisher Scientific | S209-500 | Prepare 3M stock |
| Sodium cacodylate | Polysciences, Inc. | 1131 | Toxic: wear appropriate protection. Prepare 400mM stock |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | BP327-1 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-3 | Sodium chloride |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| 10% Tween 20 | Thermo Scientific | 28320 | Surfact-Amps |
| 10% Triton X-100 | Thermo Scientific | 28314 | Surfact-Amps |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| Note: All solutions are prepared using sterile ultrapure water and should be sterilized either by autoclave or filter sterilization. | |||
| TE buffer | 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH = 8.0 | ||
| 20X SSC (Saline Sodium Citrate) | 3 M NaCl, 300 mM sodium citrate | ||
| 2X cacodylate fix solution | Toxic: wear appropriate protection. 200 mM sodium cacodylate, 200 mM sucrose, 80 mM sodium acetate, 20 mM EGTA | ||
| 1.1X Hybridization buffer | 3.3X SSC, 55% formamide, 11% dextran sulfate | ||
| Fix solution | Toxic: wear appropriate protection. 4% formaldehyde, 1X cacodylate fix solution | ||
| PBSBTx | 1X PBS, 0.5% BSA, 0.1% Trition X-100 | ||
| PBSTx | 1X PBS, 1% Trition X-100 | ||
| Extraction buffer (PBSTx + Rnase) | 1X PBS, 1% Trition X-100, 100 µg/mL RNase | ||
| 2X SSCT | 2X SSC, 0.1% Tween 20 | ||
| 2X SSCT + 20% formamide | Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 20% formamide | ||
| 2X SSCT + 40% formamide | Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 40% formamide | ||
| 2X SSCT + 50% formamide | Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 50% formamide | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Enzymes | |||
| AluI | New England Biolabs | R0137S | |
| HaeIII | New England Biolabs | R0108S | |
| MseI | New England Biolabs | R0525S | |
| MspI | New England Biolabs | R0106S | |
| RsaI | New England Biolabs | R0167S | |
| BfuCI | New England Biolabs | R0636S | |
| 100X BSA | New England Biolabs | Comes with NEB enzymes | |
| 10X NEB buffer #2 | New England Biolabs | Restriction enzyme digestion buffer. Comes with NEB enzymes | |
| Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) 400 U/µl | Roche/Sigma | 3333566001 | |
| TdT buffer | Roche/Sigma | Comes with TdT enzyme | |
| Cobalt chloride | Roche/Sigma | Toxic: wear appropriate protection. Comes with TdT enzyme | |
| RNase A (10 mg/mL) | Thermo-Scientific | EN0531 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytology Tools etc. | |||
| Forceps | Dumont | #5 INOX, Biologie | |
| 9” Disposable glass Pasteur pipettes | Fisher | 13-678-20C | Autoclave to sterilize |
| Shallow glass dissecting dish | Custom made | ||
| Deep well dish (3 wells) | Pyrex | 7223-34 | |
| Fisherfinest Premium microscope slides | Fisher Scientific | 22-038-104 | Used to cover deep well dishes |
| Frosted glass slides, 25 x 75 mm | VWR Scientific | 48312-002 | |
| Glass slides, 3 x 1 in, 1 mm thick | Thermo-Scientific | 3051 | |
| Coverslips, 10 x 10 mm, No. 1.5 | Thermo-Scientific | 3405 | |
| Tungsten needle | homemade | ||
| Prolong GOLD mounting media | Molecular Probes | P36930 | |
| Compressed-air in can | Various | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| PCR machine | Various | ||
| Nanodrop 2000, spectrophotometer | Thermo-Scientific | microvolume spectrophotometer | |
| Vortexer | Various | ||
| Table top microfuge at room temperature | Various | ||
| Table top microfuge at 4 °C | Various | ||
| Heat block | Various | ||
| Hybridization oven or incubator with rotator | Various | ||
| Nutator | Various | ||
| A1RSi laser scanning confoal | Nikon | 40X oil Plan Fluor DIC (NA 1.3) | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables etc. | |||
| 50 mL conical tubes | Various | ||
| 15 mL conical tubes | Various | ||
| 1.5 mL microfuge tubes | Various | ||
| 500 µl microfuge tubes | Various | ||
| 200 µl PCR tubes | Various | ||
| Plastic container with tight fitting lid | Various | To hold Drierite | |
| Kimwipes | Various | disposable wipes | |
| Parafilm | Various | paraffin film | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 기타 | |||
| HPLC purified 5'-labeled oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | Cy3-labeled probes that recognize the 359 bp satellite repeat of the X chromosome | |
| Volocity 3D Image Analysis Software | PerkinElmer | Version 6.3 |
References
- Peters, J. M., Nishiyama, T. Sister chromatid cohesion. CSH Perspect Biol. 4 (11), (2012).
- McNicoll, F., Stevense, M., Jessberger, R. Cohesin in gametogenesis. Curr Top Dev Biol. 102, 1-34 (2013).
- Buonomo, S. B., et al. Disjunction of homologous chromosomes in meiosis I depends on proteolytic cleavage of the meiotic cohesin Rec8 by separin. Cell. 103 (3), 387-398 (2000).
- Bickel, S. E., Orr-Weaver, T., Balicky, E. M. The sister-chromatid cohesion protein ORD is required for chiasma maintenance in Drosophila oocytes. Curr. Biol. 12 (11), 925-929 (2002).
- Hodges, C. A., Revenkova, E., Jessberger, R., Hassold, T. J., Hunt, P. A. SMC1beta-deficient female mice provide evidence that cohesins are a missing link in age-related nondisjunction. Nat Genet. 37 (12), 1351-1355 (2005).
- Freeman, S. B., et al. The National Down Syndrome Project: design and implementation. Public Health Rep. 122 (1), 62-72 (2007).
- Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nat Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).
- Angell, R. R. First-meiotic-division nondisjunction in human oocytes. Am. J. Hum. Genet. 61, 23-32 (1997).
- Tsutsumi, M., et al. Age-related decrease of meiotic cohesins in human oocytes. PLoS One. 9 (5), e96710 (2014).
- Liu, L., Keefe, D. L. Defective cohesin is associated with age-dependent misaligned chromosomes in oocytes. Reprod Biomed Online. 16 (1), 103-112 (2008).
- Subramanian, V. V., Bickel, S. E. Aging predisposes oocytes to meiotic nondisjunction when the cohesin subunit SMC1 is reduced. PLoS Genet. 4 (11), e1000263 (2008).
- Chiang, T., Duncan, F. E., Schindler, K., Schultz, R. M., Lampson, M. A. Evidence that weakened centromere cohesion is a leading cause of age-related aneuploidy in oocytes. Curr. Biol. 20 (17), 1522-1528 (2010).
- Lister, L. M., et al. Age-related meiotic segregation errors in mammalian oocytes are preceded by depletion of cohesin and Sgo2. Curr. Biol. 20 (17), 1511-1521 (2010).
- Duncan, F. E., et al. Chromosome cohesion decreases in human eggs with advanced maternal age. Aging Cell. 11 (6), 1121-1124 (2012).
- Yun, Y., Lane, S. I., Jones, K. T. Premature dyad separation in meiosis II is the major segregation error with maternal age in mouse oocytes. Development. 141 (1), 199-208 (2014).
- Subramanian, V. V., Bickel, S. E. Heterochromatin-mediated association of achiasmate homologues declines with age when cohesion is compromised. 유전학. 181, 1207-1218 (2009).
- Jeffreys, C. A., Burrage, P. S., Bickel, S. E. A model system for increased meiotic nondisjunction in older oocytes. Curr. Biol. 13 (6), 498-503 (2003).
- Weng, K. A., Jeffreys, C. A., Bickel, S. E. Rejuvenation of Meiotic Cohesion in Oocytes during Prophase I Is Required for Chiasma Maintenance and Accurate Chromosome Segregation. PLoS Genetics. 10 (9), e1004607 (2014).
- Perkins, A. T., Das, T. M., Panzera, L. C., Bickel, S. E. Oxidative stress in oocytes during midprophase induces premature loss of cohesion and chromosome segregation errors. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (44), E6823-E6830 (2016).
- Dernburg, A. F., Sedat, J. W., Hawley, R. S. Direct evidence of a role for heterochromatin in meiotic chromosome segregation. Cell. 86, 135-146 (1996).
- Dernburg, A. F., Sedat, J. W. . Method Cell Biol. 53, 187-233 (1998).
- Guo, Z., Batiha, O., Bourouh, M., Fifield, E., Swan, A. Role of Securin, Separase and Cohesins in female meiosis and polar body formation in Drosophila. J Cell Sci. 129 (3), 531-542 (2016).
- Giauque, C. C., Bickel, S. E. Heterochromatin-Associated Proteins HP1a and Piwi Collaborate to Maintain the Association of Achiasmate Homologs in Drosophila Oocytes. 유전학. 203 (1), 173-189 (2016).
- Joyce, E. F., Apostolopoulos, N., Beliveau, B. J., Wu, C. T. Germline progenitors escape the widespread phenomenon of homolog pairing during Drosophila development. PLoS Genet. 9 (12), e1004013 (2013).
- Gilliland, W. D., Hughes, S. F., Vietti, D. R., Hawley, R. S. Congression of achiasmate chromosomes to the metaphase plate in Drosophila melanogaster oocytes. Dev Biol. 325 (1), 122-128 (2009).
- Gyuricza, M. R., et al. Dynamic and Stable Cohesins Regulate Synaptonemal Complex Assembly and Chromosome Segregation. Curr Biol. 26 (13), 1688-1698 (2016).
- Radford, S. J., McKim, K. S. Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes. J Vis Exp. (116), (2016).
