Valutazione delle terapie con cellule staminali in un modello di lesione bilaterale del tendine Patellar in ratti

Summary

Questo articolo descrive la preparazione e la valutazione di cordone ombelicale cellule staminali mesenchimali derivate matrice sferoidi con un modello di difetto bilaterale del tendine patellar in un ratto. Questo modello è stato associato con una morbilità accettabile ed è stato trovato per rilevare le differenze tra i tendini non trattati e trattati e tra i due trattamenti testato.

Abstract

Medicina rigenerativa fornisce romanzo alternative a condizioni che sfidano i trattamenti tradizionali. La prevalenza e la morbosità di tendinopathy tra le specie, combinata con le proprietà curative limitate di questo tessuto, hanno richiesto la ricerca di terapie cellulari e azionato lo sviluppo di modelli sperimentali per studiare la loro efficacia. Cordone ombelicale matrix-derivate cellule staminali mesenchimali (UCM-MSC) sono candidati attraenti perché sono abbondanti, facili da raccogliere, eludere le preoccupazioni di ordine etico e il rischio di formazione di teratoma, ma assomigliano più molto attentamente a cellule staminali embrionali primitive rispetto adulto tessuto-derivato MSCs. significativo interesse si è focalizzato su chitosano come strategia per migliorare le proprietà di MSCs attraverso la formazione della sferoide. Questa carta dettagli tecniche per isolare UCM-MSCs, preparare sferoidi su pellicola di chitosano e analizzare l’effetto di formazione della sferoide sull’espressione di superficie dell’indicatore. Di conseguenza, creazione di un modello di lesione bilaterale del tendine patellar in ratti è descritto per l’impianto in vivo di UCM-MSC sferoidi formata sulla pellicola di chitosano. Nessuna complicazione è stata osservata nello studio rispetto alla morbosità, sottolineare crescenti effetti, o l’infezione del tessuto. Il Punteggio totale funzionale dei ratti operati alle 7 giorni era inferiore a quello dei ratti normali, ma hanno rinviato al normale entro 28 giorni dopo la chirurgia. Istologici punteggi di guarigione del tessuto ha confermato la presenza di un coagulo nei trattati difetti valutati a 7 giorni, assenza di reazione da corpo estraneo e progredendo guarigione a 28 giorni. Questo modello di difetto del tendine della rotula bilaterale controlla la variabilità inter-individuale tramite creazione di un controllo interno in ogni ratto, era associato con la morbosità accettabile e ha permesso la rilevazione delle differenze tra i tendini non trattati e trattamenti.

Introduction

Lesione del tendine è una delle più comuni cause di atrofia del muscolo e dolore significativo tra specie¹. In medicina veterinaria, tendine e lesioni ai legamenti sono di particolare interesse per i cavalli, come 82% di tutte le lesioni in cavalli da corsa coinvolgere il sistema muscolo-scheletrico, e 46% di quelli interessare tendini e legamenti^2,3. Formazione di tessuto cicatriziale colpisce le proprietà biomeccaniche dei tendini guariti e spiega la prognosi custodita per ritorno all’uso atletico dopo lesioni del tendine del flessore; re-infortunio si verifica entro 2 anni in fino al 67% di cavalli trattati conservativamente⁴. Medicina rigenerativa fornisce alternative romanzo ad una condizione che sfida i trattamenti tradizionali. Terapia con cellule staminali autologhe ha prodotto alcuni risultati incoraggianti^5,6 , ma è limitata dalla morbosità connessa con la raccolta di tessuto, amministrazione in ritardo a causa di elaborazione/riprogrammazione delle cellule e l’influenza della lo stato di salute del paziente (ad esempio età) sulle proprietà delle staminali cellule^7,8. Queste limitazioni forniscono una spiegazione razionale per lo studio di cellule staminali allogeniche in alternativa disponibile immediatamente. Cellule derivate da annessi fetali sono candidati attraenti perché essi eludere le preoccupazioni di ordine etico e rischio di formazione di teratoma è associata con le cellule staminali embrionali. Tra annessi fetali, matrice del cordone ombelicale (UCM), anche denominato gelatina di Wharton, è abbondante e facile da raccogliere.

Indipendentemente dall’origine delle cellule, migliorando la staminalità è indispensabile istituire una banca di cellule per trapianto allogenico medicina rigenerativa. Da un punto di vista funzionale, staminalità può definirsi il potenziale di differenziazione di auto-rinnovamento e multi-lignaggio⁹. Prova di staminalità si basa sulla proliferazione e differenziamento saggi, con l’espressione di gene marcatori Oct4, Sox2 e Nanog⁹. Una strategia per migliorare la staminalità si basa sull’uso di biomateriali per servire come Sub riempitivi e vettori migliorando la proliferazione e la differenziazione di UCM-MSCs. Questo approccio elimina le preoccupazioni relative alla manipolazione di fattori trascrizionali per riprogrammare cellule mature in cellule pluripotenti indotte. Tra biomateriali considerati come potenziali vettori per le cellule staminali, chitosano è attraente per la sua biocompatibilità e degradabilità¹⁰. Questo aminopolysaccharide naturale è formata da deacetilazione alcalina della chitina, il secondo più abbondante polisaccaride naturale, ottenuta principalmente come un sottoprodotti di crostacei¹⁰. In precedenza abbiamo studiato le interazioni tra MSCs e chitosano scaffold e osservato la formazione di sferoidi^{11,12,13,14,15, 16}. abbiamo anche segnalato sulla superiorità di Condrogenesi il chitosano matrici^{12,13,14,15,16,17, 18}. Più recentemente, due studi indipendenti hanno descritto sferoidi formazione di tessuto adiposo e placenta tessuto derivato MSCs coltivate su una pellicola di chitosano^19,20. Questa formazione di sferoidi non solo migliorato la staminalità, ma anche migliorato la conservazione di cellule staminali dopo in vivo l’impianto²⁰.

La prevalenza e la morbosità di tendinopathy attraverso le specie hanno richiesto lo sviluppo di modelli sperimentali per studiare la fisiopatologia delle tendinopatie e testare nuove terapie come iniezioni di cellule staminali. Nei cavalli, indotta da collagenosi tendinite è un modello comune per dimostrare l’efficacia utilizzando MSCs nel tendine riparazione²¹. La rilevanza di questo approccio è limitata, come iniezioni causano cambiamenti infiammatori acuti, mentre tendinopatie cliniche sono generalmente frutto di cronica affaticare^22,23. Inoltre, induzione chimica della malattia del tendine induce una risposta di guarigione e non replica il processo di guarigione alterato presente in casi clinici^22,23. L’asportazione di un segmento del tendine flessore superficiale è stato descritto come un modello chirurgico di tendinite in cavalli²⁴. Più recentemente, è stato utilizzato un approccio mini-invasivo per limitare il danno traumatico al nucleo centrale del tendine flessore superficiale²⁵. Modelli chirurgici non simulare il meccanismo di affaticamento che può condurre alla malattia naturale del tendine e tendono alla mancanza di riproducibilità nell’entità del danno creato²⁵. Indipendentemente dal modello, morbilità e costi associati modelli equine del tendine malattie sono ulteriori limitazioni, che giustificano un interesse nei modelli del roditore come un primo passo per la valutazione in vivo di nuove terapie.

Uno dei principali vantaggi dei modelli sperimentali in roditori è costituito dal costo e la capacità di controllare la variabilità inter-individuale. Roditori possono essere standardizzate riguardo ai vari fattori fisiologici a causa dei loro tassi di crescita rapida e relativamente brevi durate, limitazione delle fonti di variazione e riducendo pertanto il numero di animali necessari per rilevare le differenze. Strategie per indurre malattie del tendine in roditori hanno contato su induzione chimica, ma anche sulla creazione chirurgica di parziale del tendine difetti²¹. Modelli chirurgici possono simulare naturale tendinopatie meglio di modelli chimici, ma possono portare a più alta morbilità e fallimento catastrofico del tendine danneggiato. A tale proposito, ratti sembrano candidati migliori rispetto ai topi per questi modelli, come la loro dimensione consente la creazione di più grandi difetti, facilitando così la valutazione della guarigione dei tessuti. Ratti Sprague-Dawley sono stati utilizzati in studi sperimentali di tendinopatie in quattro gruppi principali del tendine: cuffia dei rotatori, flessori, Achille e tendini patellar²⁶. Tra questi modelli che coinvolgono il tendine rotuleo sono particolarmente attraente per la taglia più grande di questo tendine e la facilità di accesso allo stesso²⁷. Il tendine rotuleo si attacca il muscolo quadricipite alla tuberosità tibiale. All’interno di questo meccanismo dell’estensore, la rotula è un osso sesamoide che dirige l’azione del quadricipite e delinea il limite prossimale del tendine rotuleo. La presenza di ancoraggi ossute gli extent prossimali e distali del tendine patellar facilita prove biomeccaniche. Modelli che tipicamente coinvolgono il tendine rotuleo si basano sui vizi chirurgiche unilaterale, con un tendine intatto controlaterale che serve come un controllo^28,29. Il modello più diffuso di difetto tendine rotuleo coinvolge asportare la parte centrale (1 mm di larghezza) del tendine rotuleo dall’apice distale della rotula per l’inserimento della tuberosità tibiale, mentre il tendine rotuleo controlaterale è lasciato intatto. Misure dei risultati hanno incluso l’istologia, prove biomeccaniche distruttive o prove biomeccaniche per fallimento, formazione immagine di ultrasuono, ex vivo imaging di fluorescenza, lordo osservazione e test funzionali^{28,30 ,31}. Modelli unilaterale non permettere il confronto di un trattamento proposto con l’amministrazione conservatrice di una ferita simile all’interno dello stesso animale. Allo stesso modo, il confronto tra diversi trattamenti richiede animali separati. Un modello bilaterale sarebbe eliminare le variazioni inter-individuali e ridurre il numero di animali necessari per un Studio³². Tuttavia, le lesioni bilaterali possono aumentare la morbosità e zoppia bilaterale potrebbe ostacolare la valutazione della terapia. Alcuni studi segnalano brevemente l’uso bilaterale del tendine patellar difetti di ratti ma si concentrano sugli effetti di trattamenti anziché amministrazione peri-attiva e morbosità del modello^33,34.

Obiettivo a lungo termine di questo studio è quello di sviluppare una strategia per migliorare la sopravvivenza di staminalità e in vivo di UCM-MSCs destinati al trapianto allogenico. Per raggiungere questo obiettivo, recentemente abbiamo segnalato staminalità migliorata di UCM-MSCs dalla formazione di sferoidi sulla pellicola di chitosano e incubazione sotto ambiente ipossico³⁵. Queste proprietà in vitro sono state associate con migliorate proprietà biomeccaniche del tendine rotuleo difetti trattati con condizionata UCM-MSCs. basato su questi risultati, il modello di difetto bilaterale del tendine patellar del ratto sembra adatto a testare il candidato trattamenti per tendine lesioni³⁶. Lo scopo dello studio segnalato qui è quello di fornire protocolli dettagliati per isolamento e caratterizzazione di UCM-MSCs, preparazione di un sistema di consegna biologico per le cellule staminali, creazione e trattamento di difetti del tendine della rotula bilaterale e post-operatorio recupero e valutazione di guarigione all’interno dei difetti dei tessuti.

Protocol

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) di Western University of Health Sciences. 1. isolamento ed espansione di cellule staminali mesenchimali da cordone ombelicale equino Matrix Ottenere la placenta da un mare adulto (incinto) dopo osservato parto e asetticamente isolare il cordone ombelicale dalla placenta. Tenere il cordone ombelicale in tampone fosfato salino (PBS) con 1% di penicillina-streptomicina (P/S) a 4 ° C …

Representative Results

Nello studio corrente, i risultati sono presentati come media ± deviazione standard (deviazione standard). Le cellule sono state isolate dai cavi ombelicali di 6 mares, e percentuale di linee cellulari isolate che esprimono ogni indicatore della superficie delle cellule sotto condizionata standard o chitosano sono stati confrontati con un test di Friedman, come un’analisi della varianza non parametrica con ripetuto misure. Per la creazione di modelli di difetto del tendine, 8 ratti sono …

Discussion

Cellule Equine sono state selezionate per questo progetto, perché alla fine abbiamo intenzione di testare candidato approcci nella gestione delle tendinopatie naturale nei cavalli. Infatti, lesioni del tendine nei cavalli sono attraenti come modelli naturali di tendinopathy nell’uomo a causa della somiglianza biologica tra il flessore digitale superficiale equino e tendine di Achille in esseri umani⁴¹. Gli indicatori di superficie delle cellule CD44, CD90, CD105, CD34 e MHC II sono stati selezion…

Materials

PBS 10X	Hyclone	SH30258.01	Consumable
Collagenase type IA	Worthington	LS004197	Consumable
DMEM low glucose	Hyclone	SH30021.FS	Consumable
Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH30910.03	Consumable
Penicillin/Streptomycin 100X	Hyclone	SV30010	Consumable
Trypsin 0.25%	Hyclone	SH30042.01	Consumable
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104	Consumable
Trypan blue	Hyclone	SV30084.01	Consumable
Dimethyl Sulfoxide	Sigma	D2650	Consumable
Chitosan	Sigma	C3646	Consumable
Sodium Hydroxide	Sigma	S8045	Consumable
Bovine Serum Albumin	Hyclone	SH30574.01	Consumable
Round bottom polystyrene tube	Corning	149591A	Consumable
Mouse anti-horse CD44 (FITC)	AbD serotec	MCA1082F	Consumable
Mouse anti-rat CD90 (FITC)	AbD serotec	MCA47FT	Consumable
Mouse anti-horse MHC-II (FITC)	AbD serotec	MCA1085F	Consumable
Mouse IgG1 (FITC) – Isotype Control	AbD serotec	MCA928F	Consumable
Mouse monoclonal [SN6] to CD105 (FITC)	abcam	ab11415	Consumable
Mouse IgG1 (FITC) – Isotype Control	abcam	ab91356	Consumable
Mouse anti-human CD34 (FITC)	BD	BDB560942	Consumable
Mouse IdG1 kappa (FITC)	BD	BDB555748	Consumable
7-AAD	BD	BDB559925	Consumable
BD Accuri C6 Flow Cytometer	BD		Equipment
Vacutainer 5ml	Med Vet International	RED5.0	Consumable
Acid-citrate-dextrose	Sigma	C3821	Consumable
Calcium Chloride	Sigma	C5670	Consumable
Sevoflurane	JD Medical	60307-320-25	Consumable
Rats	Charles River	Strain code: 400	Experimental animal
Rat surgical kit	Harvard apparatus	728942	Equipment
Surgical Blade #15	MEDLINE	MDS15115	Consumable
Rat MD's Baytril (2 mg/Tablet), Rimadyl (2 mg/Tablet)	Bio Serv	F06801	Consumable
Polyglactin 910, 5-0	Ethicon	J436G	Consumable
Eosin alchol shandon	Thermo scientific	6766007	Consumable
Harris Hematoxylin	Thermo scientific	143907	Consumable