اختيار ابتمر الحمض النووي ملزم إستر حامض فثاليك وتوصيف وتطبيق أبتاسينسور الكهروكيميائية
Summary
ويرد وضع بروتوكول للتحديد في المختبر وتوصيف الابتامرات الحمض النووي ملزم إستر حامض فثاليك الخاصة بالمجموعة. ويرد أيضا تطبيق ابتمر المحدد في أبتاسينسور الكهروكيميائية.
Abstract
حمض فثاليك أرون استرات (آيس) من المجموعات الرئيسية للملوثات العضوية الثابتة. الكشف عن مجموعة محددة من آيس المطلوب هو درجة عالية نظراً لتزايد سريع للمتجانسات. الابتامرات الحمض النووي قد طبقت متزايدة كعناصر الاعتراف على منصات بيوسينسور، ولكن الابتامرات تحديد اتجاه أهداف جزيء صغير جداً مسعور، مثل آيس، نادراً ما يقال. هذا العمل وصف أسلوب المستندة إلى حبة مصممة لتحديد الابتامرات الحمض النووي الخاصة بالمجموعة لايس. المجموعة الأمينية فونكتيوناليزيد والفثالات الفثالات (دبة-NH2) المستهدف مرساة توليفها ومعطلة في الخرز [اغروس] تنشيط الإيبوكسي، مما يتيح عرض مجموعة إستر الافثاليك في سطح المصفوفة التثبيت، و ولذلك اختيار الاضبارات الخاصة بالمجموعة. حددنا الثوابت تفارق المرشحين ابتمر بتفاعل سلسلة البلمرة الكمية مقترنة بالفصل المغناطيسي. الوشائج النسبية والانتقائية في الابتامرات لايس أخرى تحددها الاختبارات التنافسية، حيث كان يحدها المرشحين ابتمر مسبقاً إلى دبة-NH2 تعلق الخرز المغناطيسي وصدر للمادة طافية على الحضانة مع آيس تم اختبارها أو مواد أخرى التدخل المحتملة. تم تطبيق التحليل التنافسي لأنها تتيح مقارنة السطحية تقارب بين آيس أن كان لا من المجموعات الوظيفية للتثبيت السطحي. أخيرا، أظهرت تلفيق أبتاسينسور الكهروكيميائية وتستخدم للكشف عن bis(2-ethylhexyl) فتالات أولتراسينسيتيفي وانتقائية. يوفر هذا البروتوكول رؤى لاكتشاف ابتمر الجزيئات الصغيرة الأخرى مسعور.
Introduction
جنبا إلى جنب مع التنمية الاقتصادية السريعة، وتسريع التصنيع والبناء الحضري والتلوث البيئي أكثر حدة من أي وقت مضى. وتشمل الملوثات البيئية النموذجية أيونات المعادن الثقيلة والسموم والمضادات الحيوية، ومبيدات الآفات، واختلال الغدد الصماء والملوثات العضوية الثابتة (POPs). أيونات المعادن والسموم، وإلى جانب الملوثات الأخرى جزيئات صغيرة جداً التي غالباً ما تتألف من مجموعة متنوعة من متجانسات. على سبيل المثال، تتضمن الملوثات العضوية الثابتة الأكثر سمية ثنائي الفينيل متعدد الكلور (PCBs)، والهيدروكربونات العطرية (العطرية)، ثنائيات الفينيل متعدد الكلور الاثير ثنائي الفينيل، وثنائي بنزو-فالديوكسينات (PCDDs)، ديبينزوفوران متعدد الكلور (PCDFs)، والافثاليك استرات حمض (آيس)1،2، التي تتكون من العديد من متجانسات كافة. وقد أجريت الكشف عن جزيء صغير أساسا بالأساليب المستندة إلى الطيف اللوني/الجماهيري نظراً لتنوعها من التطبيقات3،4،،من56. المكتشفة في الموقع، كانت الأساليب المستندة إلى جسم مؤخرا نمواً7،،من89. ومع ذلك، نظراً لهذه الأساليب محددة للغاية لمتجانسات معينة، يجب إجراء اختبارات متعددة. ما أخطر أن المتجانسات الرواية التي تنمو بسرعة أنه لا يمكن إنشاء تلك الأجسام المضادة في الوقت المناسب. ولذلك، وضع أجهزة الاستشعار الخاصة بفريق لرصد المستويات الإجمالية لجميع المتجانسات في اختبار واحد قد توفر مقياس لا تقدر بثمن لتقييم حالة التلوث البيئي.
في الآونة الأخيرة، الابتامرات الحمض النووي طبقت على نطاق واسع كعناصر الاعتراف في مختلف المنابر بيوسينسينج بسبب قدرتها على الاعتراف بطائفة واسعة من الأهداف، من الأيونات والجزيئات الصغيرة للبروتينات والخلايا10،11 ،12. يتم تحديد الابتامرات من خلال أسلوب في المختبر يسمى التطور المنهجي من يغاندس بتخصيب الأسية (سيليكس)13،14. ويبدأ سيليكس المكتبة اليغنوكليوتيد عشوائي جديلة واحدة الاصطناعية، والذي يحتوي على حوالي 1014-1015 تسلسل. حجم المكتبة عشوائي يضمن تنوع هياكل مرشح الجيش الملكي النيبالي أو الحمض النووي. عملية سيليكس نموذجي يتكون من جولات متعددة لتخصيب اليورانيوم حتى هو إثراء المكتبة في تسلسل مع تقارب عالية وخصوصية إلى الهدف. ثم يتم تعيين تسلسل تجمع التخصيب النهائي، وثوابت التفكك (كد) وانتقائية ضد إمكانية التدخل المواد تتحدد بواسطة تقنيات مختلفة مثل تصفية ملزمة، تقارب اللوني، السطحية صدى مأكل مثل الطحين (موارد البرنامج الخاصة)، إلخ. 15
نظراً لقابلية الذوبان في الماء سيئة للغاية وعدم وجود المجموعات الوظيفية لتجميد السطحية، التحديد ابتمر من الملوثات العضوية الثابتة من الصعب نظرياً. وقد تقدما ملحوظا سيليكس الإسراع باكتشاف الابتامرات. ومع ذلك، اختيار مجموعة محددة الابتامرات للملوثات العضوية الثابتة لم قد يبلغ بعد. حتى الآن، كانت فقط الدنا ثنائي الفينيل متعدد الكلور-ربط الابتامرات مع خصوصية عالية لمتجانسات معينة حددت16. آيس تستخدم أساسا في مواد البولي فينيل كلوريد، تغيير البولي فينيل كلوريد من بلاستيك الصلب البلاستيك مرنة، وبالتالي بوصفها الملدنات. بعض آيس قد حددت كعوامل اختلال الغدد الصماء، ويمكن أن تسبب ضررا خطيرا للكبد ووظائف الكلي، تقليل حركية الحيوانات المنوية الذكور، وقد تسفر عن مورفولوجيا الحيوانات المنوية غير طبيعي وسرطان الخصية17. وأبلغ مجمع-وﻻ الابتامرات PAE الملزمة الخاصة بالمجموعة.
والهدف من هذا العمل تقديم بروتوكول ممثل لاختيار مجموعة محددة الحمض النووي الابتامرات إلى جزيئات صغيرة جداً مسعور مثل آيس، مجموعة تمثيلية من الملوثات العضوية الثابتة. ونحن أيضا بيان تطبيق ابتمر المحددة للكشف عن التلوث البيئي. يوفر هذا البروتوكول توجيهات ورؤى لاكتشاف ابتمر الجزيئات الصغيرة الأخرى مسعور.
Protocol
Representative Results
Discussion
فائدة المعلقة واحد من الابتامرات أن تحديدها من خلال الأسلوب في المختبر سيليكس، بينما الأجسام المضادة يتم إنشاؤها عن طريق إيمونوريكشنز في فيفو . ولذلك، يمكن تحديد الابتامرات مع الهدف المنشود خصوصية ظروف تجريبية مصممة تصميماً جيدا، بينما الأجسام المضادة تقتصر على الظروف الفسيول…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن ممتنون للدعم المالي من “مؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية” (21675112)، المشاريع الرئيسية لخطة لجنة التعليم ببكين (KZ201710028027) ويانجينغ الشباب الباحث البرنامج من رأس المال الطبيعي جامعة العلوم والتكنولوجيا.
Materials
| UV-2550 | Shimadzu,Japan | protocol, section 3.8.2 | |
| DNA Engnine Thermal cycler,PTC0200 | BIO-RAD | section 3.5.1.2 and 3.5.2 | |
| C1000 Touch | BIO-RAD | section 5.3.6 and 6.3 | |
| VMP3 multichannel potentiostat | Bio-Logic Science, Claix, France | section 7.4,7.8 and 7.11 | |
| Epoxy-activated Sepharose 6B | GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA) | 10220020 | argarose beads, section 2.3 and 3.3 |
| Dynabeads M-270 carboxylic acid magnetic beads | Invitrogen, USA | 420420 | magnetic beads,section 5.2. and 5.3 |
| Premix Taq Hot Start Version | Takara,Dalian,China | R028A | polymerase, section 3.5.1.1 |
| PARAFILM Sealing Membrane | Bemis, USA | PM-996 | section 3.6.5 |
| Lambda Exonuclease | Invitrogen, USA | EN0561 | section3.7.1.2.The 10 × reaction buffer is provided along with λ exonuclease by the provider. |
| Dr. GenTLE Precipitation Carrier |
Takara,Dalian,China | 9094 | section 3.6.2 and 3.8.1 |
| UNIQ-10 PAGE DNA recovery kit | Sangon Biotech (Shanghai) | B511135 | section 4.2 |
| SYBR Gold nucleic acid gel stain | Invitrogen, USA | 1811838 | nucelic acid stain dye, section 3.5.1.5 |
| SYBR Premix Ex Taq II | Takara,Dalian,China | RR820A | polymerase mix contaning polymerase and dNTPs, section 5.3.5 |
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | CAS: 1132-61-2 | section 5.2.1 |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) | Invitrogen, USA | CAS: 25952-53-8 | section 5.2.2 |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 6066-82-6 | section 5.2.3 |
| mercaptohexanol (MCH) | Sigma-Aldrich | CAS: 1633-78-9 | section 7.7 |
| Gold electrode | Shanghai Chenhua | CHI101 | section 7.4. – 7.11 |
| tris(2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) | Sigma-Aldrich | CAS: 51805-45-9 | section 7.5 |
| O-(2-Mercaptoethyl)-O'-methyl-hexa-(ethylene glycol) | Sigma-Aldrich | CAS: 651042-82-9 | section 7.7 |
| diethylhexyl phthalate (DEHP) | National Institute of Metrology, China | CAS: 117-81-7 | section 7.11 |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | CAS: 9005-64-5 | polyoxyethy-lene(20) sorbaitan monolaurate |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | CAS: 9002-93-1 | non-ionic surface active agent |
| PBS | Sigma-Aldrich | P5368 | 10 mM phosphate buffer containing 1 M NaCl, pH 7.4 |
References
- Vorkamp, K., Riget, F. F. A review of new and current-use contaminants in the Arctic environment: Evidence of long-range transport and indications of bioaccumulation. Chemosphere. 111, 379-395 (2014).
- Net, S., Sempere, R., Delmont, A., Paluselli, A., Ouddane, B. Occurrence, fate, behavior and ecotoxicological state of phthalates in different environmental matrices. Environ Sci Technol. 49 (7), 4019-4035 (2015).
- Xie, Q. L., Liu, S. H., Fan, Y. Y., Sun, J. Z., Zhang, X. K. Determination of phthalate esters in edible oils by use of QuEChERS coupled with ionic-liquid-based dispersive liquid-liquid microextraction before high-performance liquid chromatography. Anal BioanalChem. 406 (18), 4563-4569 (2014).
- Ierapetritis, I., Lioupis, A., Lampi, E. Determination of phthalates into vegetable oils by isotopic dilution gas chromatography mass spectrometry. Food Anal Methods. 7 (7), 1451-1457 (2014).
- Sun, J. Z., He, H., Liu, S. H. Determination of phthalic acid esters in Chinese white spirit using dispersive liquid-liquid microextraction coupled with sweeping beta-cyclodextrin-modified micellar electrokinetic chromatography. J Sep Sci. 37 (13), 1679-1686 (2014).
- Yilmaz, P. K., Ertas, A., Kolak, U. Simultaneous determination of seven phthalic acid esters in beverages using ultrasound and vortex-assisted dispersive liquid-liquid microextraction followed by high-performance liquid chromatography. J Sep Sci. 37 (16), 2111-2117 (2014).
- Sun, R., Zhuang, H. An ultrasensitive gold nanoparticles improved real-time immuno-PCR assay for detecting diethyl phthalate in foodstuff samples. Anal Biochem. 480, 49-57 (2015).
- Sun, R. Y., Zhuang, H. S. A sensitive heterogeneous biotin-streptavidin enzyme-linked immunosorbent assay for the determination of di-(2-ethylhexyl)phthalate (DEHP) in beverages using a specific polyclonal antibody. Anal Methods. 6 (24), 9807-9815 (2014).
- Zhou, L., Lei, Y., Zhang, D., Ahmed, S., Chen, S. An ultra-sensitive monoclonal antibody-based enzyme-linked immunosobent assay for dibutyl phthalate in human urinary. Sci Total Environ. 541, 570-578 (2016).
- Shen, J., Li, Y., Gu, H., Xia, F., Zuo, X. Recent development of sandwich assay based on the nanobiotechnologies for proteins, nucleic Acids, small Molecules, and ions. Chem Rev. 114 (15), 7631-7677 (2014).
- Yin, X. -. B. Functional nucleic acids for electrochemical and electrochemiluminescent sensing applications. TrAC, Trends Anal Chem. 33, 81-94 (2012).
- Nguyen, V. -. T., Kwon, Y. S., Gu, M. B. Aptamer-based environmental biosensors for small molecule contaminants. Curr Opin Biotechnol. 45, 15-23 (2017).
- Groher, F., Suess, B. In vitro selection of antibiotic-binding aptamers. Methods. 106, 42-50 (2016).
- Yang, K. -. A., Pei, R., Stojanovic, M. N. In vitro selection and amplification protocols for isolation of aptameric sensors for small molecules. Methods. 106, 58-65 (2016).
- Jing, M., Bowser, M. T. Methods for measuring aptamer-protein equilibria: a review. Anal. Chim. Acta. 686 (1-2), 9-18 (2011).
- Mehta, J., et al. Selection and characterization of PCB-binding DNA aptamers. Anal Chem. 84 (3), 1669-1676 (2012).
- Matsumoto, M., Hirata-Koizumi, M., Ema, M. Potential adverse effects of phthalic acid esters on human health: A review of recent studies on reproduction. Regul Toxicol Pharm. 50 (1), 37-49 (2008).
- Goodchild, J. Conjugates of oligonucleotides and modified oligonucleotides: a review of their synthesis and properties. Bioconjug Chem. 1 (3), 165-187 (1990).
- Brown, D. M. A brief history of oligonucleotide synthesis. Protocols for Oligonucleotides and Analogs: Synthesis and Properties. , 1-17 (1993).
- Reese, C. B. Oligo-and poly-nucleotides: 50 years of chemical synthesis. Org Biomol Chem. 3 (21), 3851-3868 (2005).
- Sproat, B., Colonna, F., Mullah, B., et al. An efficient method for the isolation and purification of oligoribonucleotides. Nucleos Nucleot Nucl. 14 (1-2), 255-273 (1995).
- Han, Y., et al. Selection of group-specific phthalic acid esters binding DNA aptamers via rationally designed target immobilization and applications for ultrasensitive and highly selective detection of phthalic acid esters. Anal Chem. 89 (10), 5270-5277 (2017).
- Bartlett, J. M. S., Stirling, D. A short history of the polymerase chain reaction. PCR protocols. , 3-6 (2003).
- Saiki, R. K., Scharf, S., Faloona, F., et al. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science. 230, 1350-1354 (1985).
- Albright, L. M., Slatko, B. E. Denaturing polyacrylamide gel electrophoresis. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. , A. 3B 1-A. 3B 5 (2001).
- Summer, H., Grämer, R., Dröge, P. Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (Urea PAGE). JoVE. (32), e1485 (2009).
- Jing, M., Bowser, M. T. Methods for measuring aptamer-protein equilibria: a review. Anal Chim Acta. 686 (1), 9-18 (2011).
- Sharma, T. K., Bruno, J. G., Dhiman, A. ABCs of DNA aptamer and related assay development. Biotechnol Adv. 35 (2), 275-301 (2017).
- Liu, R., et al. Signaling-probe displacement electrochemical aptamer-based sensor (SD-EAB) for detection of nanomolar kanamycin A. Electrochim Acta. 182, 516-523 (2015).
- Mendonsa, S. D., Bowser, M. T. In vitro evolution of functional DNA using capillary electrophoresis. J Am Chem Soc. 126, 20-21 (2004).
- Lou, X. H., et al. Micromagnetic selection of aptamers in microfluidic channels. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (9), 2989-2994 (2009).
- Cho, M., et al. Quantitative selection of DNA aptamers through microfluidic selection and high-throughput sequencing. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 15373-15378 (2010).
- Cho, M., et al. Quantitative selection and parallel characterization of aptamers. Proc Nat Acad Sci USA. 110 (46), 18460-18465 (2013).
- Song, K. -. M., et al. Gold nanoparticle-based colorimetric detection of kanamycin using a DNA aptamer. Anal Biochem. 415 (2), 175-181 (2011).
- Yang, Z., Ding, X., Guo, Q., et al. Second generation of signaling-probe displacement electrochemical aptasensor for detection of picomolar ampicillin and sulfadimethoxine. Sens Actuators B. 253 (2017), 1129-1136 (2017).
- Lou, X., Zhao, T., Liu, R., Ma, J., Xiao, Y. Self-assembled DNA monolayer buffered dynamic ranges of mercuric electrochemical sensor. Anal Chem. 85 (15), 7574-7580 (2013).
- Zhao, T., et al. Nanoprobe-enhanced, split aptamer-based electrochemical sandwich assay for ultrasensitive detection of small molecules. Anal Chem. 87 (15), 7712-7719 (2015).
- Lou, X., He, L. A. Surface passivation using oligo(ethylene glycol) in ATRP-assisted DNA detection. Sens Actuators,B. 129 (1), 225-230 (2008).
