Phthalic एसिड एस्टर-बंधन डीएनए Aptamer चयन, लक्षण वर्णन, और एक विद्युत Aptasensor के लिए आवेदन
Summary
इन विट्रो चयन और समूह-विशिष्ट phthalic एसिड एस्टर बाइंडिंग डीएनए aptamers के लक्षण वर्णन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है । एक विद्युत aptasensor में चयनित aptamer के आवेदन को भी शामिल किया गया है ।
Abstract
Phthalic एसिड एस्टर्स (पेस) लगातार कार्बनिक प्रदूषकों के प्रमुख समूहों की areone । congeners के तेजी से बढ़ने के कारण पेस का समूह-विशिष्ट पता लगाना अत्यधिक वांछित है. डीएनए aptamers तेजी से किया गया है पर मांयता तत्वों के रूप में लागू करने के लिए, सेंसर प्लेटफार्मों, लेकिन aptamers का चयन अत्यधिक hydrophobic छोटे अणु लक्ष्य, जैसे कि पेस, शायद ही कभी सूचना दी है । यह काम एक मनका-आधारित पद्धति का वर्णन करता है जो पेस को समूह-विशिष्ट डीएनए aptamers का चयन करने के लिए बनाया गया है । एमिनो समूह कार्यात्मक dibutyl phthalate (DBP-एनएच2) के रूप में लंगर लक्ष्य संश्लेषित और epoxy पर स्थिर agarose मोतियों का था, की अनुमति स्थिरीकरण मैट्रिक्स की सतह पर phthalic एस्टर समूह के प्रदर्शन को, और इसलिए समूह विशेष के बांधकों का चयन । हम मात्रात्मक बहुलकीकरण श्रृंखला चुंबकीय जुदाई के साथ मिलकर प्रतिक्रिया द्वारा aptamer उंमीदवारों की पृथक्करण स्थिरांक निर्धारित किया है । अंय पेस को aptamers के रिश्तेदार समानताएं और selectivity प्रतिस्पर्धी परख द्वारा निर्धारित किया गया, जहां aptamer उंमीदवारों पूर्व थे DBP-NH2 संलग्न चुंबकीय मोती और के साथ मशीन पर supernatant को रिहा करने के लिए बाध्य परीक्षित पेस या अन्य संभावित हस्तक्षेप करने वाले पदार्थ हैं. प्रतिस्पर्धी परख क्योंकि यह पेस के बीच एक सतही संबंध तुलना कि सतह स्थिरीकरण के लिए कोई कार्यात्मक समूह था प्रदान लागू किया गया था । अंत में, हम एक विद्युत aptasensor के निर्माण का प्रदर्शन किया और ultrasensitive और बीआईएस (2-ethylhexyl) phthalate के चयनात्मक पता लगाने के लिए यह प्रयोग । यह प्रोटोकॉल अंय hydrophobic छोटे अणुओं की aptamer खोज के लिए अंतर्दृष्टि प्रदान करता है ।
Introduction
तेजी से आर्थिक विकास के साथ-साथ औद्योगीकरण का त्वरण और शहरी निर्माण, पर्यावरण प्रदूषण पहले से कहीं अधिक गंभीर है । ठेठ पर्यावरणीय प्रदूषक भारी धातु आयनों, विषाक्त पदार्थों, एंटीबायोटिक दवाओं, कीटनाशकों, अंत-स्रावी अवरोधों, और लगातार कार्बनिक प्रदूषक (चबूतरे) शामिल हैं । धातु आयनों और विषाक्त पदार्थों के अलावा, अंय प्रदूषकों छोटे अणु है कि अक्सर congeners की एक किस्म से मिलकर बना रहे हैं । उदाहरण के लिए, सबसे विषैले चबूतरे में शामिल हैं polychlorinated biphenyls (पीसीबी), एरोमेटिक खुशबूदार हाइड्रोकार्बन (PAHs), polybrominated biphenyl ईथर (PBDEs), polychlorinated dibenzo-पी-डाइअॉकॉ्सिन (PCDDs), polychlorinated dibenzofuran (PCDFs), और phthalic एसिड एस्टर (पेस)1,2, जो सभी कई congeners से मिलकर बनता है । छोटे अणु का पता लगाने के मुख्य रूप से क्रोमैटोग्राफी/जन स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित तकनीक द्वारा किया गया है अनुप्रयोगों की अपनी विविधता के कारण3,4,5,6। ऑन-साइट डिटेक्शन के लिए, एंटीबॉडी-आधारित विधियों को हाल ही में7,8,9विकसित किया गया है । हालांकि, के बाद से इन पद्धतियों एक निश्चित congener के लिए अत्यधिक विशिष्ट हैं, एकाधिक परीक्षण किया जाना चाहिए । इससे ज्यादा गंभीर क्या है कि उपन्यास congeners इतनी तेजी से बढे कि उनके एंटीबॉडी को समय पर उत्पन्न न किया जा सके । इसलिए, एक परीक्षण में सभी congeners के कुल स्तरों की निगरानी करने के लिए समूह विशेष के विकास के लिए एक अमूल्य मीट्रिक पर्यावरण प्रदूषण की स्थिति का आकलन करने के लिए प्रदान कर सकते हैं ।
हाल ही में, न्यूक्लिक एसिड aptamers व्यापक रूप से कई लक्ष्यों की एक विस्तृत विविधता पहचानने की उनकी क्षमता के कारण विभिंन संवेदन प्लेटफार्मों में मांयता तत्वों के रूप में लागू किया गया है, आयनों और छोटे अणुओं से प्रोटीन और कोशिकाओं के लिए10,11 ,12. Aptamers एक इन विट्रो विधि के माध्यम से की पहचान कर रहे है घातीय संवर्धन (SELEX)13,14द्वारा लाइगैंडों के व्यवस्थित विकास बुलाया । SELEX यादृच्छिक सिंथेटिक एकल किनारा oligonucleotide पुस्तकालय है, जो लगभग 1014-1015 दृश्यों में शामिल है के साथ शुरू होता है । यादृच्छिक पुस्तकालय का आकार आरएनए या डीएनए उंमीदवार संरचनाओं की विविधता सुनिश्चित करता है । ठेठ SELEX प्रक्रिया संवर्धन के कई दौर के होते है जब तक पुस्तकालय उच्च समानता और लक्ष्य को विशिष्टता के साथ दृश्यों में समृद्ध है । अंतिम समृद्ध पूल तो अनुक्रम है, और पृथक्करण स्थिरांक (Kd) और संभावित हस्तक्षेप करने वाले पदार्थों के विरुद्ध selectivity विभिंन तकनीकों द्वारा निर्धारित किए जाते है जैसे कि फ़िल्टर बाइंडिंग, संबध क्रोमैटोग्राफी, सरफ़ेस plasmon अनुनाद (SPR), आदि। 15
अत्यंत खराब पानी घुलनशीलता और सतह स्थिरीकरण के लिए कार्यात्मक समूहों की कमी के कारण, चबूतरे का aptamer चयन सैद्धांतिक रूप से कठिन है । SELEX के लिए महत्वपूर्ण प्रगति ने aptamers की खोज को गति दे ली है । हालांकि, चबूतरे के लिए समूह विशेष aptamers के चयन की रिपोर्ट अभी नहीं आई है । अब तक, केवल पीसीबी बाध्यकारी डीएनए aptamers एक निश्चित congener के लिए उच्च विशिष्टता के साथ16पहचान की गई है । पेस मुख्य रूप से polyvinyl क्लोराइड सामग्री में प्रयोग किया जाता है, polyvinyl क्लोराइड एक कठिन प्लास्टिक से एक लोचदार प्लास्टिक से बदल रहा है, इस प्रकार एक plasticizer के रूप में कार्य । कुछ पेस अंत: स्रावी अवरोधकों के रूप में पहचान की गई है, जिगर और गुर्दे समारोह के लिए गंभीर क्षति हो सकती है, पुरुष शुक्राणु के गतिशीलता को कम, और असामान्य शुक्राणु आकृति विज्ञान और वृषण कैंसर में परिणाम हो सकता है17. न तो यौगिक-और न ही समूह-विशिष्ट PAE-बाइंडिंग aptamers रिपोर्ट किया गया है ।
इस कार्य का लक्ष्य उच्च hydrophobic छोटे अणुओं जैसे पेस, चबूतरे का एक प्रतिनिधि समूह के लिए समूह-विशिष्ट डीएनए aptamers के चयन के लिए एक प्रतिनिधि प्रोटोकॉल प्रदान करना है. हम पर्यावरण प्रदूषण का पता लगाने के लिए चयनित aptamer के आवेदन भी प्रदर्शित करते हैं । यह प्रोटोकॉल अंय hydrophobic छोटे अणुओं की aptamer खोज के लिए मार्गदर्शन और अंतर्दृष्टि प्रदान करता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
aptamers के एक उत्कृष्ट लाभ यह है कि वे के माध्यम से पहचाना जाता है इन विट्रो विधि SELEX, जबकि एंटीबॉडी के माध्यम से उत्पंन कर रहे है vivo immunoreactions में । इसलिए, aptamers अच्छी तरह से डिजाइन प्रयोगात्मक शर्तों के तहत वा?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (२१६७५११२) से वित्तीय सहायता के लिए आभारी हैं, बीजिंग शिक्षा आयोग (KZ201710028027) की विज्ञान और प्रौद्योगिकी योजना की प्रमुख परियोजना और राजधानी सामान्य विश्वविद्यालय के Yanjing युवा विद्वान कार्यक्रम.
Materials
| UV-2550 | Shimadzu,Japan | protocol, section 3.8.2 | |
| DNA Engnine Thermal cycler,PTC0200 | BIO-RAD | section 3.5.1.2 and 3.5.2 | |
| C1000 Touch | BIO-RAD | section 5.3.6 and 6.3 | |
| VMP3 multichannel potentiostat | Bio-Logic Science, Claix, France | section 7.4,7.8 and 7.11 | |
| Epoxy-activated Sepharose 6B | GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA) | 10220020 | argarose beads, section 2.3 and 3.3 |
| Dynabeads M-270 carboxylic acid magnetic beads | Invitrogen, USA | 420420 | magnetic beads,section 5.2. and 5.3 |
| Premix Taq Hot Start Version | Takara,Dalian,China | R028A | polymerase, section 3.5.1.1 |
| PARAFILM Sealing Membrane | Bemis, USA | PM-996 | section 3.6.5 |
| Lambda Exonuclease | Invitrogen, USA | EN0561 | section3.7.1.2.The 10 × reaction buffer is provided along with λ exonuclease by the provider. |
| Dr. GenTLE Precipitation Carrier |
Takara,Dalian,China | 9094 | section 3.6.2 and 3.8.1 |
| UNIQ-10 PAGE DNA recovery kit | Sangon Biotech (Shanghai) | B511135 | section 4.2 |
| SYBR Gold nucleic acid gel stain | Invitrogen, USA | 1811838 | nucelic acid stain dye, section 3.5.1.5 |
| SYBR Premix Ex Taq II | Takara,Dalian,China | RR820A | polymerase mix contaning polymerase and dNTPs, section 5.3.5 |
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | CAS: 1132-61-2 | section 5.2.1 |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) | Invitrogen, USA | CAS: 25952-53-8 | section 5.2.2 |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 6066-82-6 | section 5.2.3 |
| mercaptohexanol (MCH) | Sigma-Aldrich | CAS: 1633-78-9 | section 7.7 |
| Gold electrode | Shanghai Chenhua | CHI101 | section 7.4. – 7.11 |
| tris(2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) | Sigma-Aldrich | CAS: 51805-45-9 | section 7.5 |
| O-(2-Mercaptoethyl)-O'-methyl-hexa-(ethylene glycol) | Sigma-Aldrich | CAS: 651042-82-9 | section 7.7 |
| diethylhexyl phthalate (DEHP) | National Institute of Metrology, China | CAS: 117-81-7 | section 7.11 |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | CAS: 9005-64-5 | polyoxyethy-lene(20) sorbaitan monolaurate |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | CAS: 9002-93-1 | non-ionic surface active agent |
| PBS | Sigma-Aldrich | P5368 | 10 mM phosphate buffer containing 1 M NaCl, pH 7.4 |
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