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화학

Acido ftalico Ester-associazione DNA aptamero selezione, caratterizzazione e applicazione di un Aptasensor elettrochimica

Published: March 21, 2018
doi:
10.3791/56814
, , , , ,
1Department of Chemistry,Capital Normal University, 2College of Life Sciences,Capital Normal University

Summary

Un protocollo per la selezione in vitro e caratterizzazione di aptameri di DNA specifico del gruppo acido ftalico estere-associazione è presentato. È inclusa anche l’applicazione dell’aptamero selezionato in un aptasensor elettrochimico.

Abstract

Acido ftalico esteri (PAEs) sonouno dei principali gruppi di inquinanti organici persistenti. La rilevazione di gruppo-specifica del PAEs altamente è voluta a causa la rapida crescita dei congeneri. Aptameri di DNA sono state applicate sempre più come elementi di riconoscimento su piattaforme di biosensore, ma selezionando aptameri verso obiettivi altamente idrofobo piccola molecola, come PAEs, sono segnalata raramente. Questo lavoro descrive un metodo basato su tallone progettato per selezionare aptameri di DNA specifico del gruppo di PAEs. Il gruppo amminico funzionalizzati ftalato di dibutile (DBP-NH2) come la destinazione di ancoraggio è stata sintetizzata e immobilizzata le perline di agarosio epossi-attivato, consentendo la visualizzazione del gruppo estere ftalico alla superficie della matrice immobilizzazione, e pertanto la selezione dei leganti specifici del gruppo. Abbiamo determinato le costanti di dissociazione dei candidati aptamero da reazione a catena quantitativa polimerizzazione accoppiato con separazione magnetica. La relativa affinità e selettività di aptameri per altri PAEs sono stati determinati mediante le analisi competitive, dove i candidati aptamero pre-sono stati limitati al DBP-NH2 allegata biglie magnetiche e rilasciato al supernatante sopra incubazione con il PAEs testata o altri potenziali sostanze interferenti. Prova competitiva è stata applicata perché esso fornito un confronto facile affinità tra PAEs che non aveva nessun gruppi funzionali per immobilizzazione superficiale. Infine, abbiamo dimostrato la realizzazione di un aptasensor elettrochimico e usato per rilevazione ultrasensibile e selettivo di 2-etilesilftalato. Questo protocollo fornisce intuizioni per la scoperta di aptamero di altre piccole molecole idrofobiche.

Introduction

Insieme a rapido sviluppo economico, accelerazione di industrializzazione e costruzione urbana, l’inquinamento ambientale è più grave che mai. Inquinanti ambientali tipici includono ioni di metalli pesanti, tossine, antibiotici, pesticidi, endocrini e inquinanti organici persistenti (pop). Oltre a ioni metallici e le tossine, altri inquinanti sono piccole molecole che molto spesso consistono in una varietà di congeneri. Ad esempio, il pop più tossici includono i policlorobifenili (PCB), idrocarburi policiclici aromatici (IPA), eteri di difenile polibromurati (PBDE), policloro dibenzo-p-diossine (PCDD), difenili policlorodibenzofurani (PCDF) e ftalico esteri dell’acido (PAEs)1,2, che tutti sono costituiti da numerosi congeneri. Rilevamento di piccola molecola è stata eseguita principalmente da tecniche basate sulla spettrometria di massa/cromatografia a causa della loro diversità di applicazioni3,4,5,6. Per i rilevamenti in loco, metodi basati su anticorpi sono stati recentemente sviluppati7,8,9. Tuttavia, poiché questi metodi sono altamente specifici per un certo congenere, prove multiple devono essere eseguite. Che cosa è più grave è che i romanzo congeneri crescono così in fretta che loro gli anticorpi non possono essere generati nel tempo. Pertanto, lo sviluppo di biosensori di gruppo-specifici per monitorare i livelli totali di tutti i congeneri in un test può fornire una preziosa metrica per valutare lo stato di inquinamento ambientale.

Recentemente, l’acido nucleico aptameri sono stati ampiamente applicati come elementi di riconoscimento in varie piattaforme di biosensori grazie alla loro capacità di riconoscere un’ampia varietà di obiettivi, di ioni e piccole molecole di proteine e cellule10,11 ,12. Aptameri sono identificati attraverso un metodo in vitro chiamato evoluzione sistematica di ligandi di arricchimento esponenziale (SELEX)13,14. SELEX si inizia con la libreria di oligonucleotide sintetico casuale singolo filamento, che contiene circa 1014-1015 sequenze. La dimensione della biblioteca casuale garantisce la diversità delle strutture candidato RNA o DNA. Il processo SELEX tipico è costituito da più cicli di arricchimento fino a quando la libreria viene arricchita in sequenze con alta affinità e specificità per la destinazione. La piscina arricchita finale è quindi sequenziata, e le costanti di dissociazione (Kd) e la selettività contro potenziali sostanze interferenti sono determinati da diverse tecniche quali filtrano vincolanti, cromatografia di affinità, superficie risonanza plasmonica (SPR), ecc. 15

A causa della solubilità in acqua estremamente povera e la mancanza di gruppi funzionali per immobilizzazione superficiale, la selezione di aptamero di POPs è teoricamente difficile. Progressi significativi per SELEX hanno velocizzato la scoperta di aptameri. Tuttavia, la selezione di gruppo-specifici aptameri per POPs non è stato ancora segnalata. Finora, solo il PCB-associazione DNA aptameri con alta specificità per un certo congenere sono stati individuati16. PAEs sono utilizzati principalmente in materiali di cloruro di polivinile, cloruro di polivinile il passaggio da una plastica dura a una plastica elastica, agendo quindi come un plastificante. Alcuni PAEs sono stati identificati come interferenti endocrini, può causare gravi danni alla funzionalità epatica e renale, ridurre la motilità degli spermatozoi maschili e può provocare morfologia anormale dello sperma e cancro testicolare17. Composto – né aptameri PAE-associazione gruppo-specifici sono stati segnalati.

L’obiettivo di questo lavoro è quello di fornire un protocollo rappresentativo per la selezione di aptameri di DNA specifico del gruppo a altamente idrofobi piccole molecole quali PAEs, un gruppo rappresentativo di POPs. Inoltre dimostriamo l’applicazione dell’aptamero selezionato per il rilevamento di inquinamento ambientale. Questo protocollo fornisce indicazioni e spunti per la scoperta di aptamero di altre piccole molecole idrofobiche.

Protocol

1. biblioteca e disegno dell’iniettore e sintesi Progettare la Biblioteca iniziale e primer.Biblioteca (piscina0): 5′-TCCCACGCATTCTCCACATC-N40-CCTTTCTGTCCTTCCGTCAC-3’Forward primer (FP): 5′-TCCCACGCATTCTCCACATC-3’Fosforilato reverse primer (PO4- RP): 5′-PO4- GTGACGGAAGGACAGAAAGG-3′ Sintetizzare piscina0, FP e PO4- RP utilizzando standard phosphoramidite chimica18,19…

Representative Results

Abbiamo progettato e sintetizzato il gruppo amminico funzionalizzato dibutilftalato (DBP-NH2) come la destinazione di ancoraggio (Figura 1F). Abbiamo quindi effettuato la selezione aptamero del DNA di PAEs utilizzando DBP-NH2 come destinazione ancoraggio e seguendo il metodo di immobilizzazione-base classica destinazione (Figura 2). In ogni round, un pilota PCR è stata effettuata utilizzando la pagina denat…

Discussion

Uno dei vantaggi eccezionale di aptameri è che vengono identificati tramite il metodo in vitro SELEX, mentre gli anticorpi sono generati tramite immunoreactions in vivo . Pertanto, è possono selezionare aptameri con specificità di destinazione desiderata in condizioni sperimentali ben progettate, considerando che gli anticorpi sono limitati a condizioni fisiologiche.

Per facilitare la separazione delle sequenze associati da sequenze gratuiti, diversi SELEX modificate recen…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Siamo grati per il sostegno finanziario della National Natural Science Foundation (21675112), progetto di chiave del piano di scienza e tecnologia di Pechino Education Commission (KZ201710028027) e programma di Yanjing giovane studioso di Capital Normal University.

Materials

UV-2550 Shimadzu,Japan protocol, section 3.8.2
DNA Engnine Thermal cycler,PTC0200 BIO-RAD section 3.5.1.2 and 3.5.2
C1000 Touch BIO-RAD section 5.3.6 and 6.3
VMP3 multichannel potentiostat Bio-Logic Science, Claix, France section 7.4,7.8 and 7.11
Epoxy-activated Sepharose 6B GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA) 10220020 argarose beads, section 2.3 and 3.3
Dynabeads M-270 carboxylic acid magnetic beads Invitrogen, USA 420420 magnetic beads,section 5.2. and 5.3
Premix Taq Hot Start Version Takara,Dalian,China R028A polymerase, section 3.5.1.1
PARAFILM Sealing Membrane Bemis, USA PM-996 section 3.6.5
Lambda Exonuclease Invitrogen, USA EN0561 section3.7.1.2.The 10 × reaction buffer is provided along with λ exonuclease by the provider.
Dr. GenTLE
Precipitation Carrier		 Takara,Dalian,China 9094 section 3.6.2 and 3.8.1
UNIQ-10 PAGE DNA recovery kit Sangon Biotech (Shanghai) B511135 section 4.2
SYBR Gold nucleic acid gel stain Invitrogen, USA 1811838 nucelic acid stain dye, section 3.5.1.5
SYBR Premix Ex Taq II Takara,Dalian,China RR820A polymerase mix contaning polymerase and dNTPs, section 5.3.5
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) Sigma-Aldrich CAS: 1132-61-2 section 5.2.1
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) Invitrogen, USA CAS: 25952-53-8 section 5.2.2
N-hydroxysuccinimide (NHS) Sigma-Aldrich 6066-82-6 section 5.2.3
mercaptohexanol (MCH) Sigma-Aldrich CAS: 1633-78-9 section 7.7
Gold electrode Shanghai Chenhua CHI101 section 7.4. – 7.11
tris(2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) Sigma-Aldrich CAS: 51805-45-9 section 7.5
O-(2-Mercaptoethyl)-O'-methyl-hexa-(ethylene glycol) Sigma-Aldrich CAS: 651042-82-9 section 7.7
diethylhexyl phthalate (DEHP) National Institute of Metrology, China CAS: 117-81-7 section 7.11
Tween 20 Sigma-Aldrich CAS: 9005-64-5 polyoxyethy-lene(20) sorbaitan monolaurate
Triton X-100 Sigma-Aldrich CAS: 9002-93-1 non-ionic surface active agent
PBS Sigma-Aldrich P5368 10 mM phosphate buffer containing 1 M NaCl, pH 7.4
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References

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Keywords: Phthalic Acid EsterDNA AptamerElectrochemical AptasensorHydrophobic MoleculesGroup-specific AptamersLambda ExonucleaseNative PAGE GelMagnetic BeadsPAE Binding Buffer
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Wu, X., Diao, D., Lu, Z., Han, Y., Xu, S., Lou, X. Phthalic Acid Ester-Binding DNA Aptamer Selection, Characterization, and Application to an Electrochemical Aptasensor. J. Vis. Exp. (133), e56814, doi:10.3791/56814 (2018).
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