Phthalic 산 에스테 르-바인딩 DNA Aptamer 선택, 특성, 및 전기 화학 Aptasensor 응용 프로그램
Summary
생체 외에서 선택 및 그룹 관련 phthalic 산 에스테 르-바인딩 DNA aptamers의 특성화에 대 한 프로토콜 제공 됩니다. 전기 aptasensor에서 선택 된 aptamer의 응용 프로그램이 포함 되어 있습니다.
Abstract
지속적인 유기 오염 물질의 주요 그룹의 phthalic 산 에스테 르 (PAEs) areone. PAEs의 그룹 전용 탐지는 congeners의 급속 한 성장으로 인해 매우 원한다. 점점 더 인식 요소 바이오 센서 플랫폼에 적용 된 DNA aptamers 하지만 선택 aptamers PAEs, 등 매우 소수 성 분자 표적으로 보고 거의. 이 작업 그룹-특정 DNA aptamers PAEs 선택 하도록 설계 된 비드 기반 방법을 설명 합니다. 아미노 그룹 공업화 틸 프 탈 레이트 (DBP-NH2) 앵커 대상 합성 했 고 에폭시 활성화 agarose 구슬에 움직일 immobilization 매트릭스의 표면에서 phthalic 에스테 르 그룹의 표시를 허용 하 고 따라서 그룹 전용 바인더의 선택. 자력 분리와 결합 하는 정량적 중 합 연쇄 반응에 따라 aptamer 후보자의 분리 상수 하 고. 상대 선호도 다른 PAEs에 aptamers의 선택도 경쟁 분석 실험에 의해 결정 되었다 aptamer 후보 DBP NH2 미리 경계 했다 연결 된 자석 구슬, 가진 외피에 상쾌한에 발표 테스트 PAEs 또는 다른 잠재적인 간섭 물질입니다. 경쟁 분석 결과 표면 동원 정지에 대 한 기능 그룹이 했다 PAEs 중 손쉬운 선호도 비교를 제공 하기 때문에 적용 되었다. 마지막으로 우리 전기 aptasensor의 제작을 시연 하 고 bis(2-ethylhexyl) 프 탈 레이트의 磁 및 선택적 검출을 위해 사용. 이 프로토콜 다른 소수 작은 분자의 aptamer 발견에 대 한 통찰력을 제공합니다.
Introduction
급속 한 경제 발전, 함께 산업화, 그리고 도시 건설, 환경 오염의 가속 그 어느 때 보다 더 심각 하다. 일반적인 환경 오염 물질 중 금속 이온, 독 소, 항생제, 농약, 내 분 비 분리기와 지속적인 유기 오염 물질 (Pop)을 포함합니다. 금속 이온과 독 소, 외 다른 오염 물질은 작은 분자는 꽤 congeners의 다양 한 구성 됩니다. 가장 독성 Pop 비페닐 (PCBs), 다 환 방향족 탄화수소 (PAHs), 폴 리 브롬 화 비페닐 에테르 (PBDEs), polychlorinated dibenzo-p-다이옥신 (PCDDs), polychlorinated dibenzofuran (PCDFs)를 포함 하는 예를 들어 고 phthalic 산 에스테 르 (PAEs)1,–2모든 많은 congeners의 구성. 작은 분자 검출 크로마토그래피/질량 분석 기반 기술을 응용 프로그램3,4,,56의 그들의 다양성 때문에 의해 주로 수행 되었습니다. 사이트 검색에 대 한 항 체 기반 방법을 최근 개발된7,,89되었습니다 합니다. 그러나, 이러한 방법은 특정 느리기에 대 한 매우 구체적인 이기 때문에, 여러 테스트를 수행 합니다. 더 심각한 것은 소설 congeners 성장 빠른 시간에 그들의 항 체를 생성할 수 없습니다. 따라서, 한 테스트에 모든 congeners의 총 레벨 모니터링 하 그룹 관련 바이오 센서의 개발 환경 오염 상태를 평가 하기 위한 귀중 한 통계를 제공할 수 있습니다.
최근, 핵 산 aptamers 널리 적용 된 다양 한 바이오 센 싱 플랫폼 다양 한 이온과 단백질 및 세포10,11 작은 분자에서 대상 인식의 그들의 기능 때문에 인식 요소 ,12. Aptamers는 시험관에 의해 호출 된 메서드 ligands의 체계적인 발전 지 수 농축 (SELEX)13,14을 통해 식별 됩니다. SELEX는 약 1014-1015 시퀀스 포함 임의의 합성 단일 가닥 oligonucleotide 도서관으로 시작 합니다. 무작위 라이브러리의 크기는 RNA 또는 DNA 후보 구조의 다양성을 보장합니다. 전형적인 SELEX 프로세스 라이브러리는 높은 친 화력 및 특이성 대상 시퀀스에 농축 될 때까지 농축의 여러 라운드로 구성. 최종 농축된 수영장 다음 시퀀스와 분리 상수 (Kd) 및 간섭 물질과 같은 다른 기술에 의해 결정 하는 잠재력에 대 한 선택 필터 바인딩, 친화성 크로마토그래피, 표면 플라스몬 공명 (SPR), 등. 15
매우 빈약한 물 가용성과 표면 동원 정지에 대 한 기능 그룹의 부족, pop aptamer 선택은 이론적으로 어렵습니다. SELEX에 대 한 중요 한 발전 aptamers 발견 가속화 했습니다. 그러나, 팝에 대 한 그룹별 aptamers의 선택은 하지 아직 알려졌다. 지금까지 특정 느리기에 대 한 높은 특이성으로 PCB 바인딩 DNA aptamers만 확인 된16되었습니다. PAEs는 주로 폴 리 염화 비닐 물자, 탄력 있는 플라스틱, 따라서 가소제 역할 하드 플라스틱에서 폴 리 염화 비닐을 변경에 사용 됩니다. 일부 PAEs 내 분 비 분리기로 확인 되었습니다, 심각한 손상을 일으킬 수 간 및 신장 기능, 남성 정자의 운동 성 감소 하 고 비정상적인 정자 형태와 고환 암17발생할 수 있습니다. 화합물-도 그룹 전용 PAE 바인딩 aptamers 보고 되었습니다.
이 작품의 목표 그룹-특정 DNA aptamers PAEs, 팝의 대표 그룹 등 매우 소수 작은 분자를 선택 하기 위한 대표적인 프로토콜을 제공 하는 것입니다. 우리는 또한 환경 오염 감지를 위한 선택 된 aptamer의 응용 프로그램을 보여 줍니다. 이 프로토콜 다른 소수 작은 분자의 aptamer 발견에 대 한 지침과 통찰력을 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aptamers의 뛰어난 이점 중 하나입니다 vivo에서 immunoreactions를 통해 항 체를 생성 하는 동안 그들은 체 외에서 방법을 SELEX 통해 식별 됩니다. 따라서, 항 체는 생리 적 조건에 제한 하는 반면 aptamers 잘 설계 된 실험 조건에서 원하는 대상으로 선택할 수 있습니다.
무료 시퀀스에서 바운드 시퀀스의 분리를 촉진 하기 위하여 몇 가지 수정 된 SELEX 최근 보고 되었습니다,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 국립 자연 과학 재단 (21675112), 베이징 교육 위원회 (KZ201710028027)와 Yanjing 젊은 학자 프로그램의 수도 사범 대학의 과학 및 기술 계획의 프로젝트에서에서 재정 지원에 대 한 감사.
Materials
| UV-2550 | Shimadzu,Japan | protocol, section 3.8.2 | |
| DNA Engnine Thermal cycler,PTC0200 | BIO-RAD | section 3.5.1.2 and 3.5.2 | |
| C1000 Touch | BIO-RAD | section 5.3.6 and 6.3 | |
| VMP3 multichannel potentiostat | Bio-Logic Science, Claix, France | section 7.4,7.8 and 7.11 | |
| Epoxy-activated Sepharose 6B | GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA) | 10220020 | argarose beads, section 2.3 and 3.3 |
| Dynabeads M-270 carboxylic acid magnetic beads | Invitrogen, USA | 420420 | magnetic beads,section 5.2. and 5.3 |
| Premix Taq Hot Start Version | Takara,Dalian,China | R028A | polymerase, section 3.5.1.1 |
| PARAFILM Sealing Membrane | Bemis, USA | PM-996 | section 3.6.5 |
| Lambda Exonuclease | Invitrogen, USA | EN0561 | section3.7.1.2.The 10 × reaction buffer is provided along with λ exonuclease by the provider. |
| Dr. GenTLE Precipitation Carrier |
Takara,Dalian,China | 9094 | section 3.6.2 and 3.8.1 |
| UNIQ-10 PAGE DNA recovery kit | Sangon Biotech (Shanghai) | B511135 | section 4.2 |
| SYBR Gold nucleic acid gel stain | Invitrogen, USA | 1811838 | nucelic acid stain dye, section 3.5.1.5 |
| SYBR Premix Ex Taq II | Takara,Dalian,China | RR820A | polymerase mix contaning polymerase and dNTPs, section 5.3.5 |
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | CAS: 1132-61-2 | section 5.2.1 |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) | Invitrogen, USA | CAS: 25952-53-8 | section 5.2.2 |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 6066-82-6 | section 5.2.3 |
| mercaptohexanol (MCH) | Sigma-Aldrich | CAS: 1633-78-9 | section 7.7 |
| Gold electrode | Shanghai Chenhua | CHI101 | section 7.4. – 7.11 |
| tris(2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) | Sigma-Aldrich | CAS: 51805-45-9 | section 7.5 |
| O-(2-Mercaptoethyl)-O'-methyl-hexa-(ethylene glycol) | Sigma-Aldrich | CAS: 651042-82-9 | section 7.7 |
| diethylhexyl phthalate (DEHP) | National Institute of Metrology, China | CAS: 117-81-7 | section 7.11 |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | CAS: 9005-64-5 | polyoxyethy-lene(20) sorbaitan monolaurate |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | CAS: 9002-93-1 | non-ionic surface active agent |
| PBS | Sigma-Aldrich | P5368 | 10 mM phosphate buffer containing 1 M NaCl, pH 7.4 |
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