Ftalsyra Ester-bindande DNA Aptamer urval, karakterisering och för att en elektrokemisk Aptasensor
Summary
Ett protokoll för in vitro- urval och karakterisering av gruppspecifika ftalsyra ester-bindande DNA aptamers presenteras. Tillämpningen av den valda aptamer i en elektrokemisk aptasensor ingår också.
Abstract
Ftalsyra estrar (PAEs) areone för de stora grupperna av långlivade organiska föroreningar. Gruppspecifika detektion av PAEs är mycket önskvärt på grund av den snabbt växande kongeners. DNA aptamers har använts alltmer som erkännande element på biosensor plattformar, men välja aptamers mot starkt hydrofoba småmolekylära mål, såsom PAEs, rapporteras sällan. Detta arbete beskriver en pärla-baserade metod utformad för att välja gruppspecifika DNA aptamers att PAEs. Den amino gruppen functionalized dibutylftalat (DBP-NH2) som ankare målet var syntetiseras och orörlig på epoxi-aktiverat agaros pärlor, vilket möjliggör visning av ftalsyra ester gruppen vid ytan av immobilisering matrisen, och därför valet av de gruppspecifika bindemedel. Vi utifrån kvantitativa polymerisation kedjereaktion tillsammans med magnetisk separering dissociation konstanterna aptamer kandidater. Den relativa tillhörighet och selektivitet i aptamers till andra PAEs bestämdes av de konkurrenskraftiga analyserna, där aptamer kandidaterna var pre avgränsas till DBP-NH2 fäst magnetiska pärlor och befriaren till supernatanten vid inkubation med de testade PAEs eller andra potentiellt interfererande substanser. Konkurrenskraftiga analysen tillämpades eftersom det gav en lättköpt affinitet jämförelse bland PAEs som hade inga funktionella grupper för surface immobilisering. Slutligen, vi visade tillverkning av en elektrokemisk aptasensor och använde den för ultrasensitive och selektiv påvisande av bis(2-ethylhexyl) ftalat. Detta protokoll ger insikter för aptamer upptäckten av andra hydrofoba små molekyler.
Introduction
Tillsammans med snabb ekonomisk utveckling är acceleration av industrialisering och stadsbyggnad, miljöföroreningar allvarligare än någonsin. Typiska miljögifter inkluderar tungmetall joner, toxiner, antibiotika, bekämpningsmedel, hormonstörande ämnen och långlivade organiska föroreningar (pop). Förutom metalljoner och toxiner, andra föroreningar är små molekyler som ganska ofta består av en mängd olika kongener. Till exempel de giftigaste dyker inkludera polycykliska aromatiska kolväten (PAH), polyklorerade dibenso-p-dioxiner (PCDD), polybromerade bifenyler etrar (PBDE), polyklorerade bifenyler (PCB), polyklorerade dibensofurankongener (PCDF), och ftalsyra syra estrar (PAEs)1,2, som alla består av många kongener. Liten molekyl upptäckt har huvudsakligen utförts av chromatography/mass spectrometry-baserade tekniker på grund av sin mångfald av program3,4,5,6. För hotellets upptäckter, har antikroppsbaserade metoder nyligen varit utvecklade7,8,9. Men eftersom dessa metoder är mycket specifika för en viss kongen, måste flera tester utföras. Allvarligare är att de nya kongenerna växer så fort att deras antikroppar inte kan genereras i tid. Därför kan utvecklingen av gruppspecifika biosensorer att övervaka de totala nivåerna av alla kongener i ett test ge en ovärderlig metriska för bedömning av miljöföroreningar.
Nyligen, nukleinsyra aptamers har tillämpats allmänt erkännande element i olika biosensing plattformar på grund av deras förmåga att känna igen en mängd olika mål, från joner och små molekyler till proteiner och celler10,11 ,12. Aptamers identifieras genom en in vitro- metod kallas systematisk utveckling av ligander av exponentiell anrikning (SELEX)13,14. SELEX börjar med slumpmässiga syntetiska enda strand oligonukleotiden biblioteket, som innehåller cirka 1014-1015 sekvenser. Storleken på slumpmässiga biblioteket garanterar mångfalden av RNA eller DNA kandidat strukturer. Den typiska SELEX-processen består av flera rundor av anrikning tills biblioteket är berikad i sekvenser med hög affinitet och specificitet till målet. Slutliga berikad poolen sedan sekvenseras och den dissociation konstanter (Kd) och selektivitet mot potentiella störande ämnen bestäms av olika tekniker såsom filtrera bindande, affinitetskromatografi, yta Plasmon resonans (SPR), etc. 15
På grund av det extremt dåliga vattenlöslighet och funktionella grupper för surface immobilisering är aptamer dyker teoretiskt svårt. Betydande framsteg för SELEX har snabbat upp upptäckten av aptamers. Men har urvalet av gruppspecifika aptamers för POPs ännu inte har rapporterats. Bara PCB-bindande DNA aptamers med hög specificitet för en viss kongen har hittills varit identifierade16. PAEs används främst i polyvinylklorid material, ändra polyvinylklorid från en hård plast till en elastisk plast, vilket fungerar som en mjukgörare. Vissa PAEs har identifierats som hormonstörande ämnen, kan orsaka allvarliga skador till lever- och njurfunktion, minska motiliteten av manliga spermier, och kan resultera i onormal spermiernas morfologi och testikelcancer17. Varken förening- eller gruppspecifika PAE-bindande aptamers har rapporterats.
Målet med detta arbete är att tillhandahålla ett representativt protokoll för att välja gruppspecifika DNA aptamers till starkt hydrofoba små molekyler som PAEs, en representativ grupp av långlivade organiska föroreningar. Vi visar även tillämpningen av den valda aptamer för miljöföroreningar upptäckt. Detta protokoll ger vägledning och insikter för aptamer upptäckten av andra hydrofoba små molekyler.
Protocol
Representative Results
Discussion
En enastående fördel med aptamerer är att de identifieras genom in vitro- metoden SELEX, medan antikroppar genereras via i vivo immunoreactions. Aptamers kan därför väljas med önskat mål specificitet väldesignade experimental villkor, medan antikroppar är begränsade till fysiologiska förhållanden.
För att underlätta separering av bundna sekvenser från gratis sekvenser, har flera modifierade SELEX nyligen rapporterats, i vilka kapillärelektrofores<sup class="x…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi är tacksamma för finansiellt stöd från National Natural Science Foundation (21675112), nyckel projektera av vetenskap och teknik planerar av Beijing utbildningskommissionen (KZ201710028027) och Yanjing ung Scholar Program av kapital Normal University.
Materials
| UV-2550 | Shimadzu,Japan | protocol, section 3.8.2 | |
| DNA Engnine Thermal cycler,PTC0200 | BIO-RAD | section 3.5.1.2 and 3.5.2 | |
| C1000 Touch | BIO-RAD | section 5.3.6 and 6.3 | |
| VMP3 multichannel potentiostat | Bio-Logic Science, Claix, France | section 7.4,7.8 and 7.11 | |
| Epoxy-activated Sepharose 6B | GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA) | 10220020 | argarose beads, section 2.3 and 3.3 |
| Dynabeads M-270 carboxylic acid magnetic beads | Invitrogen, USA | 420420 | magnetic beads,section 5.2. and 5.3 |
| Premix Taq Hot Start Version | Takara,Dalian,China | R028A | polymerase, section 3.5.1.1 |
| PARAFILM Sealing Membrane | Bemis, USA | PM-996 | section 3.6.5 |
| Lambda Exonuclease | Invitrogen, USA | EN0561 | section3.7.1.2.The 10 × reaction buffer is provided along with λ exonuclease by the provider. |
| Dr. GenTLE Precipitation Carrier |
Takara,Dalian,China | 9094 | section 3.6.2 and 3.8.1 |
| UNIQ-10 PAGE DNA recovery kit | Sangon Biotech (Shanghai) | B511135 | section 4.2 |
| SYBR Gold nucleic acid gel stain | Invitrogen, USA | 1811838 | nucelic acid stain dye, section 3.5.1.5 |
| SYBR Premix Ex Taq II | Takara,Dalian,China | RR820A | polymerase mix contaning polymerase and dNTPs, section 5.3.5 |
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | CAS: 1132-61-2 | section 5.2.1 |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) | Invitrogen, USA | CAS: 25952-53-8 | section 5.2.2 |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 6066-82-6 | section 5.2.3 |
| mercaptohexanol (MCH) | Sigma-Aldrich | CAS: 1633-78-9 | section 7.7 |
| Gold electrode | Shanghai Chenhua | CHI101 | section 7.4. – 7.11 |
| tris(2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) | Sigma-Aldrich | CAS: 51805-45-9 | section 7.5 |
| O-(2-Mercaptoethyl)-O'-methyl-hexa-(ethylene glycol) | Sigma-Aldrich | CAS: 651042-82-9 | section 7.7 |
| diethylhexyl phthalate (DEHP) | National Institute of Metrology, China | CAS: 117-81-7 | section 7.11 |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | CAS: 9005-64-5 | polyoxyethy-lene(20) sorbaitan monolaurate |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | CAS: 9002-93-1 | non-ionic surface active agent |
| PBS | Sigma-Aldrich | P5368 | 10 mM phosphate buffer containing 1 M NaCl, pH 7.4 |
References
- Vorkamp, K., Riget, F. F. A review of new and current-use contaminants in the Arctic environment: Evidence of long-range transport and indications of bioaccumulation. Chemosphere. 111, 379-395 (2014).
- Net, S., Sempere, R., Delmont, A., Paluselli, A., Ouddane, B. Occurrence, fate, behavior and ecotoxicological state of phthalates in different environmental matrices. Environ Sci Technol. 49 (7), 4019-4035 (2015).
- Xie, Q. L., Liu, S. H., Fan, Y. Y., Sun, J. Z., Zhang, X. K. Determination of phthalate esters in edible oils by use of QuEChERS coupled with ionic-liquid-based dispersive liquid-liquid microextraction before high-performance liquid chromatography. Anal BioanalChem. 406 (18), 4563-4569 (2014).
- Ierapetritis, I., Lioupis, A., Lampi, E. Determination of phthalates into vegetable oils by isotopic dilution gas chromatography mass spectrometry. Food Anal Methods. 7 (7), 1451-1457 (2014).
- Sun, J. Z., He, H., Liu, S. H. Determination of phthalic acid esters in Chinese white spirit using dispersive liquid-liquid microextraction coupled with sweeping beta-cyclodextrin-modified micellar electrokinetic chromatography. J Sep Sci. 37 (13), 1679-1686 (2014).
- Yilmaz, P. K., Ertas, A., Kolak, U. Simultaneous determination of seven phthalic acid esters in beverages using ultrasound and vortex-assisted dispersive liquid-liquid microextraction followed by high-performance liquid chromatography. J Sep Sci. 37 (16), 2111-2117 (2014).
- Sun, R., Zhuang, H. An ultrasensitive gold nanoparticles improved real-time immuno-PCR assay for detecting diethyl phthalate in foodstuff samples. Anal Biochem. 480, 49-57 (2015).
- Sun, R. Y., Zhuang, H. S. A sensitive heterogeneous biotin-streptavidin enzyme-linked immunosorbent assay for the determination of di-(2-ethylhexyl)phthalate (DEHP) in beverages using a specific polyclonal antibody. Anal Methods. 6 (24), 9807-9815 (2014).
- Zhou, L., Lei, Y., Zhang, D., Ahmed, S., Chen, S. An ultra-sensitive monoclonal antibody-based enzyme-linked immunosobent assay for dibutyl phthalate in human urinary. Sci Total Environ. 541, 570-578 (2016).
- Shen, J., Li, Y., Gu, H., Xia, F., Zuo, X. Recent development of sandwich assay based on the nanobiotechnologies for proteins, nucleic Acids, small Molecules, and ions. Chem Rev. 114 (15), 7631-7677 (2014).
- Yin, X. -. B. Functional nucleic acids for electrochemical and electrochemiluminescent sensing applications. TrAC, Trends Anal Chem. 33, 81-94 (2012).
- Nguyen, V. -. T., Kwon, Y. S., Gu, M. B. Aptamer-based environmental biosensors for small molecule contaminants. Curr Opin Biotechnol. 45, 15-23 (2017).
- Groher, F., Suess, B. In vitro selection of antibiotic-binding aptamers. Methods. 106, 42-50 (2016).
- Yang, K. -. A., Pei, R., Stojanovic, M. N. In vitro selection and amplification protocols for isolation of aptameric sensors for small molecules. Methods. 106, 58-65 (2016).
- Jing, M., Bowser, M. T. Methods for measuring aptamer-protein equilibria: a review. Anal. Chim. Acta. 686 (1-2), 9-18 (2011).
- Mehta, J., et al. Selection and characterization of PCB-binding DNA aptamers. Anal Chem. 84 (3), 1669-1676 (2012).
- Matsumoto, M., Hirata-Koizumi, M., Ema, M. Potential adverse effects of phthalic acid esters on human health: A review of recent studies on reproduction. Regul Toxicol Pharm. 50 (1), 37-49 (2008).
- Goodchild, J. Conjugates of oligonucleotides and modified oligonucleotides: a review of their synthesis and properties. Bioconjug Chem. 1 (3), 165-187 (1990).
- Brown, D. M. A brief history of oligonucleotide synthesis. Protocols for Oligonucleotides and Analogs: Synthesis and Properties. , 1-17 (1993).
- Reese, C. B. Oligo-and poly-nucleotides: 50 years of chemical synthesis. Org Biomol Chem. 3 (21), 3851-3868 (2005).
- Sproat, B., Colonna, F., Mullah, B., et al. An efficient method for the isolation and purification of oligoribonucleotides. Nucleos Nucleot Nucl. 14 (1-2), 255-273 (1995).
- Han, Y., et al. Selection of group-specific phthalic acid esters binding DNA aptamers via rationally designed target immobilization and applications for ultrasensitive and highly selective detection of phthalic acid esters. Anal Chem. 89 (10), 5270-5277 (2017).
- Bartlett, J. M. S., Stirling, D. A short history of the polymerase chain reaction. PCR protocols. , 3-6 (2003).
- Saiki, R. K., Scharf, S., Faloona, F., et al. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science. 230, 1350-1354 (1985).
- Albright, L. M., Slatko, B. E. Denaturing polyacrylamide gel electrophoresis. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. , A. 3B 1-A. 3B 5 (2001).
- Summer, H., Grämer, R., Dröge, P. Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (Urea PAGE). JoVE. (32), e1485 (2009).
- Jing, M., Bowser, M. T. Methods for measuring aptamer-protein equilibria: a review. Anal Chim Acta. 686 (1), 9-18 (2011).
- Sharma, T. K., Bruno, J. G., Dhiman, A. ABCs of DNA aptamer and related assay development. Biotechnol Adv. 35 (2), 275-301 (2017).
- Liu, R., et al. Signaling-probe displacement electrochemical aptamer-based sensor (SD-EAB) for detection of nanomolar kanamycin A. Electrochim Acta. 182, 516-523 (2015).
- Mendonsa, S. D., Bowser, M. T. In vitro evolution of functional DNA using capillary electrophoresis. J Am Chem Soc. 126, 20-21 (2004).
- Lou, X. H., et al. Micromagnetic selection of aptamers in microfluidic channels. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (9), 2989-2994 (2009).
- Cho, M., et al. Quantitative selection of DNA aptamers through microfluidic selection and high-throughput sequencing. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 15373-15378 (2010).
- Cho, M., et al. Quantitative selection and parallel characterization of aptamers. Proc Nat Acad Sci USA. 110 (46), 18460-18465 (2013).
- Song, K. -. M., et al. Gold nanoparticle-based colorimetric detection of kanamycin using a DNA aptamer. Anal Biochem. 415 (2), 175-181 (2011).
- Yang, Z., Ding, X., Guo, Q., et al. Second generation of signaling-probe displacement electrochemical aptasensor for detection of picomolar ampicillin and sulfadimethoxine. Sens Actuators B. 253 (2017), 1129-1136 (2017).
- Lou, X., Zhao, T., Liu, R., Ma, J., Xiao, Y. Self-assembled DNA monolayer buffered dynamic ranges of mercuric electrochemical sensor. Anal Chem. 85 (15), 7574-7580 (2013).
- Zhao, T., et al. Nanoprobe-enhanced, split aptamer-based electrochemical sandwich assay for ultrasensitive detection of small molecules. Anal Chem. 87 (15), 7712-7719 (2015).
- Lou, X., He, L. A. Surface passivation using oligo(ethylene glycol) in ATRP-assisted DNA detection. Sens Actuators,B. 129 (1), 225-230 (2008).
