JoVE Journal > Chemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
화학

Maddedir asit Ester-bağlama DNA Aptamer seçimi, karakterizasyonu ve elektrokimyasal bir Aptasensor uygulamaya

Published: March 21, 2018
doi:
10.3791/56814
, , , , ,
1Department of Chemistry,Capital Normal University, 2College of Life Sciences,Capital Normal University

Summary

Vitro seçimi ve gruba özgü maddedir asit ester-bağlama DNA aptamers karakterizasyonu için bir protokol sunulmuştur. Bir elektrokimyasal aptasensor içinde seçilen aptamer uygulanması da dahil edilir.

Abstract

Kalıcı organik kirleticiler ana grup maddedir asit esterleri (PAEs) bir. PAEs gruba özgü tespiti son derece congeners hızlı büyüyen nedeniyle isteniyorsa. DNA aptamers giderek Biyoalgılayıcı platformlarda tanıma öğeler olarak uygulamış olan ama PAEs gibi son derece hidrofobik küçük molekül hedefleri doğru seçme aptamers nadiren bildirilmektedir. Bu eser gruba özgü DNA aptamers PAEs için seçmek için tasarlanmış bir boncuk tabanlı yöntemi açıklar. Amino grubu functionalized Dibutil ftalat (DBP-NH2) çapa hedef sentezlenmiş ve epoksi-harekete geçirmek özel boncuk üzerinde immobilize immobilizasyon matris yüzeyde phthalic ester grubu görüntülenmesini sağlayan ve Bu nedenle gruba özel bağlayıcı seçimi. Ayrılma sabitler aptamer adayların nicel polimerizasyon zincirleme reaksiyon manyetik ayırma ile birleştiğinde tarafından belirlenir. Göreli benzeşim ve aptamers için diğer PAEs selectivity rekabetçi deneyleri tarafından belirlenmiştir, nerede aptamer adaylar için DBP-NH2 önceden birbirine bağlanmış manyetik boncuklar bağlı ve süpernatant ile kuluçka üzerine serbest test PAEs ya da diğer potansiyel sokan maddeler. Facile benzeşme karşılaştırma yüzey immobilizasyon için fonksiyonel grup vardı PAEs arasında sağlanan çünkü rekabet tahlil uygulandı. Son olarak, biz bir elektrokimyasal aptasensor imalatı gösterdi ve bis(2-ethylhexyl) ftalat vericiyi ve seçici tespiti için kullanılan. Bu iletişim kuralı anlayışlar hidrofobik diğer küçük moleküller aptamer keşfi için sağlar.

Introduction

Hızlı ekonomik kalkınma ile birlikte hızlanma sanayileşme ve kentsel inşaat, Çevre kirliliğinin her zamankinden daha şiddetli olduğunu. Tipik Çevresel kirleticiler heavy metal iyonları, toksinler, antibiyotik, tarım ilaçları, Endokrin Bozucular ve kalıcı organik kirleticiler (POPs) içerir. Metal iyonları ve toksinlerin yanı sıra, diğer kirleticilerin küçük moleküllerdir yani oldukça sık sık congeners çeşitli oluşur. Örneğin, en zehirli pop’ları içerir Poliklorlu Bifeniller (PCB), polisiklik aromatik hidrokarbonlar (PAH), polybrominated biphenyl eterler (PBDEs), Poliklorlu dibenzo-p-dioksin (PCDDs), Poliklorlu dibenzofuran (PCDFs) ve phthalic tüm oluşur birçok congeners asit esterleri (PAEs)1,2. Küçük molekül algılama esas olarak Kromatografi/Kütle spektrometresi tabanlı teknikleri nedeniyle onların çeşitlilik uygulamaları3,4,5,6tarafından yapıldı. Yerinde tespitlerde için antikor tabanlı yöntemleri gelişmiş7,8,9son zamanlarda. Bu yöntemler belirli bir türdeş için çok özel olduğu için ancak, birden çok test gerçekleştirilmelidir. Roman congeners kadar çabuk onların antikorlar zamanında oluşturulan uzuyor daha ciddi bir olmasıdır. Bu nedenle, tüm congeners bir testteki toplam düzeyde izlemek için gruba özgü biyosensörler gelişimi çevre kirliliği durumu değerlendirmek için çok değerli bir ölçüsünü sağlayabilir.

Son zamanlarda, nükleik asit aptamers yaygın tanıma öğeleri hedeflerden iyonları ve küçük moleküllerin proteinler ve hücre10,11 için çok çeşitli tanıma onların yeteneği nedeniyle çeşitli biosensing platformlar olarak uygulanmış olan ,12. Aptamers sistematik ligandlar evrimi üstel zenginleştirme (SELEX)13,14tarafından adlı bir vitro yöntemi aracılığıyla tanımlanır. SELEX yaklaşık 1014-1015 dizileri içeren rasgele sentetik tek iplikçik Oligonükleotid kitaplığı ile başlar. Rasgele Kütüphane boyutu RNA veya DNA aday yapıları çeşitlilik sağlar. Kütüphanede dizileri yüksek benzeşme ve hedef özgüllük ile zenginleştirilmiş kadar tipik SELEX işlemi zenginleştirme birden fazla mermi ile oluşur. Son zenginleştirilmiş havuzu sonra sıralı ve bağlama, benzeşim Kromatografi, yüzey ayrılma sabitleri (Kd) ve seçicilik sokan maddeler gibi farklı teknikleri tarafından belirlenir potansiyel karşı filtre Plasmon rezonans (SPR), vs. 15

Son derece kötü su çözünürlük ve Fonksiyonel grupların yüzey immobilizasyon için eksikliği nedeniyle aptamer çıkar teorik olarak zor seçimidir. SELEX için önemli gelişmeler aptamers keşfi kadar hız. Ancak, gruba özel aptamers seçim POP’lar için henüz bildirilmemiştir. Şimdiye kadar sadece PCB-bağlama DNA aptamers bir belirli türdeş için yüksek özgüllük ile tanımlanan16olmuştur. PAEs esas olarak Polivinil klorür malzemeleri, böylece bir Plastifiyan davranan bir elastik plastik sert plastikten Polivinil klorür değiştirme kullanılır. Bazı PAEs Endokrin Bozucular tespit edilmiştir, ciddi hasara neden olabilir karaciğer ve böbrek fonksiyonu, erkeğin sperm hareketliliği azaltmak ve anormal sperm morfolojisi ve testis kanseri17neden olabilir. Bileşik – kendisi ve gruba özgü PAE bağlama aptamers bildirilmiştir.

Bu eser gruba özgü DNA aptamers PAEs, pop’ları temsil eden bir grup gibi son derece hidrofobik küçük moleküllere seçmek için temsil edici bir protokol sağlar için hedeftir. Biz de çevre kirliliği algılama için seçilen aptamer uygulama göstermek. Bu iletişim kuralı, kılavuz ve anlayışlar hidrofobik diğer küçük moleküller aptamer keşfi için sağlar.

Protocol

1. Kütüphane ve astar tasarım ve sentez Tasarım ilk kütüphane ve astar.Kütüphane (havuzu0): 5′-TCCCACGCATTCTCCACATC-N40-CCTTTCTGTCCTTCCGTCAC-3’İleri astar (FP): 5′-TCCCACGCATTCTCCACATC-3’Fosforile ters astar (PO4- RP): 5′-PO4- GTGACGGAAGGACAGAAAGG-3′ Havuzu0, FP ve PO sentez4- RP standart phosphoramidite kimya18,19,20</sup…

Representative Results

Tasarlanmış ve amino grubu functionalized Dibutil ftalat (DBP-NH2) çapa hedef (şekil 1F) sentezlenmiş. Sonra DBP-NH2 çapa hedef olarak ve ardından klasik hedef immobilizasyon tabanlı yöntemi (Resim 2) kullanarak PAEs DNA aptamer seçimi gerçekleştirilir. Her turda bir pilot PCR PCR (şekil 3) döngüsü sayısı en iyi duruma getirmek için denatüre sayfası kullanı…

Discussion

Antikorlar vivo içinde immunoreactions ile oluşturulan iken SELEX, vitro yöntemle tanımlanır aptamers bir üstün faydası nedir. Bu nedenle, antikorlar için fizyolojik koşullar sınırlı ise aptamers iyi tasarlanmış deneysel koşullarda istenen hedef özgüllük ile seçilebilir.

İlişkili sıralar ayrılığı ücretsiz dizilerinden kolaylaştırmak için çeşitli değiştirilmiş SELEX son zamanlarda bildirilmiştir, hangi Kapiler Elektroforez…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Maddi destek Ulusal Doğa Bilimleri vakıf (21675112), anahtar proje Pekin Eğitim Komisyonu (KZ201710028027) ve Yanjing genç bilim adamı Program, sermaye Normal Üniversitesi bilim ve teknoloji planının minnettarız.

Materials

UV-2550 Shimadzu,Japan protocol, section 3.8.2
DNA Engnine Thermal cycler,PTC0200 BIO-RAD section 3.5.1.2 and 3.5.2
C1000 Touch BIO-RAD section 5.3.6 and 6.3
VMP3 multichannel potentiostat Bio-Logic Science, Claix, France section 7.4,7.8 and 7.11
Epoxy-activated Sepharose 6B GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA) 10220020 argarose beads, section 2.3 and 3.3
Dynabeads M-270 carboxylic acid magnetic beads Invitrogen, USA 420420 magnetic beads,section 5.2. and 5.3
Premix Taq Hot Start Version Takara,Dalian,China R028A polymerase, section 3.5.1.1
PARAFILM Sealing Membrane Bemis, USA PM-996 section 3.6.5
Lambda Exonuclease Invitrogen, USA EN0561 section3.7.1.2.The 10 × reaction buffer is provided along with λ exonuclease by the provider.
Dr. GenTLE
Precipitation Carrier		 Takara,Dalian,China 9094 section 3.6.2 and 3.8.1
UNIQ-10 PAGE DNA recovery kit Sangon Biotech (Shanghai) B511135 section 4.2
SYBR Gold nucleic acid gel stain Invitrogen, USA 1811838 nucelic acid stain dye, section 3.5.1.5
SYBR Premix Ex Taq II Takara,Dalian,China RR820A polymerase mix contaning polymerase and dNTPs, section 5.3.5
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) Sigma-Aldrich CAS: 1132-61-2 section 5.2.1
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) Invitrogen, USA CAS: 25952-53-8 section 5.2.2
N-hydroxysuccinimide (NHS) Sigma-Aldrich 6066-82-6 section 5.2.3
mercaptohexanol (MCH) Sigma-Aldrich CAS: 1633-78-9 section 7.7
Gold electrode Shanghai Chenhua CHI101 section 7.4. – 7.11
tris(2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) Sigma-Aldrich CAS: 51805-45-9 section 7.5
O-(2-Mercaptoethyl)-O'-methyl-hexa-(ethylene glycol) Sigma-Aldrich CAS: 651042-82-9 section 7.7
diethylhexyl phthalate (DEHP) National Institute of Metrology, China CAS: 117-81-7 section 7.11
Tween 20 Sigma-Aldrich CAS: 9005-64-5 polyoxyethy-lene(20) sorbaitan monolaurate
Triton X-100 Sigma-Aldrich CAS: 9002-93-1 non-ionic surface active agent
PBS Sigma-Aldrich P5368 10 mM phosphate buffer containing 1 M NaCl, pH 7.4
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vorkamp, K., Riget, F. F. A review of new and current-use contaminants in the Arctic environment: Evidence of long-range transport and indications of bioaccumulation. Chemosphere. 111, 379-395 (2014).
  2. Net, S., Sempere, R., Delmont, A., Paluselli, A., Ouddane, B. Occurrence, fate, behavior and ecotoxicological state of phthalates in different environmental matrices. Environ Sci Technol. 49 (7), 4019-4035 (2015).
  3. Xie, Q. L., Liu, S. H., Fan, Y. Y., Sun, J. Z., Zhang, X. K. Determination of phthalate esters in edible oils by use of QuEChERS coupled with ionic-liquid-based dispersive liquid-liquid microextraction before high-performance liquid chromatography. Anal BioanalChem. 406 (18), 4563-4569 (2014).
  4. Ierapetritis, I., Lioupis, A., Lampi, E. Determination of phthalates into vegetable oils by isotopic dilution gas chromatography mass spectrometry. Food Anal Methods. 7 (7), 1451-1457 (2014).
  5. Sun, J. Z., He, H., Liu, S. H. Determination of phthalic acid esters in Chinese white spirit using dispersive liquid-liquid microextraction coupled with sweeping beta-cyclodextrin-modified micellar electrokinetic chromatography. J Sep Sci. 37 (13), 1679-1686 (2014).
  6. Yilmaz, P. K., Ertas, A., Kolak, U. Simultaneous determination of seven phthalic acid esters in beverages using ultrasound and vortex-assisted dispersive liquid-liquid microextraction followed by high-performance liquid chromatography. J Sep Sci. 37 (16), 2111-2117 (2014).
  7. Sun, R., Zhuang, H. An ultrasensitive gold nanoparticles improved real-time immuno-PCR assay for detecting diethyl phthalate in foodstuff samples. Anal Biochem. 480, 49-57 (2015).
  8. Sun, R. Y., Zhuang, H. S. A sensitive heterogeneous biotin-streptavidin enzyme-linked immunosorbent assay for the determination of di-(2-ethylhexyl)phthalate (DEHP) in beverages using a specific polyclonal antibody. Anal Methods. 6 (24), 9807-9815 (2014).
  9. Zhou, L., Lei, Y., Zhang, D., Ahmed, S., Chen, S. An ultra-sensitive monoclonal antibody-based enzyme-linked immunosobent assay for dibutyl phthalate in human urinary. Sci Total Environ. 541, 570-578 (2016).
  10. Shen, J., Li, Y., Gu, H., Xia, F., Zuo, X. Recent development of sandwich assay based on the nanobiotechnologies for proteins, nucleic Acids, small Molecules, and ions. Chem Rev. 114 (15), 7631-7677 (2014).
  11. Yin, X. -. B. Functional nucleic acids for electrochemical and electrochemiluminescent sensing applications. TrAC, Trends Anal Chem. 33, 81-94 (2012).
  12. Nguyen, V. -. T., Kwon, Y. S., Gu, M. B. Aptamer-based environmental biosensors for small molecule contaminants. Curr Opin Biotechnol. 45, 15-23 (2017).
  13. Groher, F., Suess, B. In vitro selection of antibiotic-binding aptamers. Methods. 106, 42-50 (2016).
  14. Yang, K. -. A., Pei, R., Stojanovic, M. N. In vitro selection and amplification protocols for isolation of aptameric sensors for small molecules. Methods. 106, 58-65 (2016).
  15. Jing, M., Bowser, M. T. Methods for measuring aptamer-protein equilibria: a review. Anal. Chim. Acta. 686 (1-2), 9-18 (2011).
  16. Mehta, J., et al. Selection and characterization of PCB-binding DNA aptamers. Anal Chem. 84 (3), 1669-1676 (2012).
  17. Matsumoto, M., Hirata-Koizumi, M., Ema, M. Potential adverse effects of phthalic acid esters on human health: A review of recent studies on reproduction. Regul Toxicol Pharm. 50 (1), 37-49 (2008).
  18. Goodchild, J. Conjugates of oligonucleotides and modified oligonucleotides: a review of their synthesis and properties. Bioconjug Chem. 1 (3), 165-187 (1990).
  19. Brown, D. M. A brief history of oligonucleotide synthesis. Protocols for Oligonucleotides and Analogs: Synthesis and Properties. , 1-17 (1993).
  20. Reese, C. B. Oligo-and poly-nucleotides: 50 years of chemical synthesis. Org Biomol Chem. 3 (21), 3851-3868 (2005).
  21. Sproat, B., Colonna, F., Mullah, B., et al. An efficient method for the isolation and purification of oligoribonucleotides. Nucleos Nucleot Nucl. 14 (1-2), 255-273 (1995).
  22. Han, Y., et al. Selection of group-specific phthalic acid esters binding DNA aptamers via rationally designed target immobilization and applications for ultrasensitive and highly selective detection of phthalic acid esters. Anal Chem. 89 (10), 5270-5277 (2017).
  23. Bartlett, J. M. S., Stirling, D. A short history of the polymerase chain reaction. PCR protocols. , 3-6 (2003).
  24. Saiki, R. K., Scharf, S., Faloona, F., et al. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science. 230, 1350-1354 (1985).
  25. Albright, L. M., Slatko, B. E. Denaturing polyacrylamide gel electrophoresis. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. , A. 3B 1-A. 3B 5 (2001).
  26. Summer, H., Grämer, R., Dröge, P. Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (Urea PAGE). JoVE. (32), e1485 (2009).
  27. Jing, M., Bowser, M. T. Methods for measuring aptamer-protein equilibria: a review. Anal Chim Acta. 686 (1), 9-18 (2011).
  28. Sharma, T. K., Bruno, J. G., Dhiman, A. ABCs of DNA aptamer and related assay development. Biotechnol Adv. 35 (2), 275-301 (2017).
  29. Liu, R., et al. Signaling-probe displacement electrochemical aptamer-based sensor (SD-EAB) for detection of nanomolar kanamycin A. Electrochim Acta. 182, 516-523 (2015).
  30. Mendonsa, S. D., Bowser, M. T. In vitro evolution of functional DNA using capillary electrophoresis. J Am Chem Soc. 126, 20-21 (2004).
  31. Lou, X. H., et al. Micromagnetic selection of aptamers in microfluidic channels. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (9), 2989-2994 (2009).
  32. Cho, M., et al. Quantitative selection of DNA aptamers through microfluidic selection and high-throughput sequencing. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 15373-15378 (2010).
  33. Cho, M., et al. Quantitative selection and parallel characterization of aptamers. Proc Nat Acad Sci USA. 110 (46), 18460-18465 (2013).
  34. Song, K. -. M., et al. Gold nanoparticle-based colorimetric detection of kanamycin using a DNA aptamer. Anal Biochem. 415 (2), 175-181 (2011).
  35. Yang, Z., Ding, X., Guo, Q., et al. Second generation of signaling-probe displacement electrochemical aptasensor for detection of picomolar ampicillin and sulfadimethoxine. Sens Actuators B. 253 (2017), 1129-1136 (2017).
  36. Lou, X., Zhao, T., Liu, R., Ma, J., Xiao, Y. Self-assembled DNA monolayer buffered dynamic ranges of mercuric electrochemical sensor. Anal Chem. 85 (15), 7574-7580 (2013).
  37. Zhao, T., et al. Nanoprobe-enhanced, split aptamer-based electrochemical sandwich assay for ultrasensitive detection of small molecules. Anal Chem. 87 (15), 7712-7719 (2015).
  38. Lou, X., He, L. A. Surface passivation using oligo(ethylene glycol) in ATRP-assisted DNA detection. Sens Actuators,B. 129 (1), 225-230 (2008).

Tags

Keywords: Phthalic Acid EsterDNA AptamerElectrochemical AptasensorHydrophobic MoleculesGroup-specific AptamersLambda ExonucleaseNative PAGE GelMagnetic BeadsPAE Binding Buffer
check_url/kr/56814?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Wu, X., Diao, D., Lu, Z., Han, Y., Xu, S., Lou, X. Phthalic Acid Ester-Binding DNA Aptamer Selection, Characterization, and Application to an Electrochemical Aptasensor. J. Vis. Exp. (133), e56814, doi:10.3791/56814 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image