إنشاء نموذج عنصر محدود هيكلي واقعية هندسية من كارديوميوسيتي لدراسة دور البنية الخلوية في بيولوجيا الأنظمة كارديوميوسيتي
Summary
ويحدد هذا البروتوكول طريقة جديدة لإنشاء نموذج عنصر محدود مكانياً مفصلة من بنية داخل الخلايا من كارديوميوسيتيس من المجهر الإلكتروني وصور مجهرية [كنفوكل]. ويتجلى السلطة من هذا الطراز مفصلة مكانياً باستخدام دراسات الحالة في إشارات الكالسيوم والاستقلاب.
Abstract
مع ظهور تقنيات التصوير (3D) ثلاثي الأبعاد مثل التصوير المقطعي الإلكترون، المسلسل-كتلة-وجه المسح الميكروسكوب الإلكتروني والميكروسكوب [كنفوكل]، يتحمل المجتمع العلمي لم يسبق لها مثيل من الوصول إلى قواعد البيانات الكبيرة في ميكرومتر الفرعية القرار التي تتسم بها يعيد البناء المعماري الذي يرافق التغيرات في وظيفة كارديوميوسيتي في الصحة والمرض. بيد أن هذه مجموعات البيانات كانت غير مستغلة للتحقيق في دور إعادة عرض البنية الخلوية في الدالة كارديوميوسيتي. والغرض من هذا البروتوكول لتوضيح كيفية إنشاء نموذج عنصر محدود دقيقة من كارديوميوسيتي استخدام الميكروسكوب الإلكتروني عالية الدقة وصور مجهرية [كنفوكل]. نموذج مفصل ودقيق للبنية الخلوية إمكانات كبيرة لتقديم رؤى جديدة في الأحياء كارديوميوسيتي، أكثر مما يمكن كسب التجارب وحدها. السلطة من هذا الأسلوب تكمن في قدرته لالصمامات حسابياً معلومات من اثنين من طرائق التصوير المتباينة من أولتراستروكتوري كارديوميوسيتي لوضع نموذج موحد ومفصل واحد كارديوميوسيتي. هذا البروتوكول يحدد خطوات لإدماج التصوير المقطعي الإلكترون وصور مجهرية [كنفوكل] cardiomyocytes الفئران ويستار (اسم لسلالة معينة من الفئران ألبينو) الذكور الكبار لوضع نموذج عنصر محدود ساركومير النصف كارديوميوسيتي. الإجراء بإنشاء نموذج عنصر محدود ثلاثي الأبعاد يحتوي تصوير عالية الجودة والدقة (حدود ~ 35 نانومتر) لتوزيع الميتوكوندريا، ميوفيبريلس ومجموعات مستقبلات ريانوديني أن الإفراج عن الكالسيوم اللازمة كارديوميوسيتي تقلص من شبكة اتصال شبكي sarcoplasmic (ريال) في ميوفيبريل وحجرة سيتوسوليك. النموذج التي تم إنشاؤها هنا كمثال لا تتضمن تفاصيل بنية أنبوب عرضية أو شبكة اتصال شبكي sarcoplasmic وبالتالي فهو نموذج الحد أدنى كارديوميوسيتي. ومع ذلك، يمكن فعلا تطبيق النموذج في التحقيقات على أساس المحاكاة في الدور هيكل الخلية في الاستقلاب إرسال الإشارات والمتقدريه الكالسيوم، الذي يتضح وتناقش استخدام اثنين من دراسات الحالة التي ترد بعد البروتوكول مفصلاً.
Introduction
اقتران الإثارة–انكماش (ECC) في القلب يشير إلى هامة ومعقدة اقتران بين الإثارة الكهربائية للغشاء كارديوميوسيتي وانكماش الميكانيكية اللاحقة للخلية أثناء كل نبضة. النماذج الرياضية وقد لعبت دوراً رئيسيا في تطوير فهم كمي للعمليات الكيميائية الحيوية المترابطة التي تنظم إمكانية العمل1، سيتوسوليك الكالسيوم مما يشير إلى2،3من الاستقلاب، واللاحقة توليد القوة الهوس. هذه النماذج أيضا بنجاح وتوقع تغييرات لنبضات القلب عند واحد أو العديد من هذه العمليات البيوكيميائية الخضوع للتعديلات4،5. يتزايد الاعتراف أولتراستروكتوري تنظيم درجة عالية من كارديوميوسيتي تلعب دوراً حاسما في الدالة الهوس العادي للخلية والقلب كله. في الواقع، تحدث التغييرات في مورفولوجيا وتنظيم مكونات أولتراستروكتوري القلب بالتوازي مع التغيرات البيوكيميائية في ظروف المرض مثل تضخم6،7من فشل القلب والسكري اعتلال عضلة القلب8. ما إذا كانت هذه التغييرات الهيكلية الردود المرضية البسيطة أو التكيف لتغير الظروف الكيميائية الحيوية لا تزال مجهولة إلى حد بعيد9. اقتران ضيق أصلاً بين الشكل والوظيفة في البيولوجيا يعني أن الدراسات التجريبية وحدها لا يمكن أن يوفر رؤى أعمق من العلاقات المتبادلة بين يعيد البناء الهيكلي والدالة كارديوميوسيتي. جيل جديد من النماذج الرياضية التي يمكن أن تدمج الجمعية الهيكلية من المكونات الفرعية الخلوية، جنبا إلى جنب مع العمليات البيوكيميائية مدروسة، ضرورية لتطوير فهم شامل، والكمي للعلاقة بين هيكل والكيمياء الحيوية والقوة الهوس في cardiomyocytes. هذا البروتوكول توضح هذه المقالة الطرق التي يمكن استخدامها لتوليد نماذج عنصر محدود هيكلي دقيقة من كارديوميوسيتيس التي يمكن استخدامها لمثل هذه التحقيقات.
شهد العقد الماضي تقدما ملحوظا في الميكروسكوب الإلكتروني 3D10و [كنفوكل]11مجهرية فائقة القرار12 التي تقدم أفكاراً لم يسبق لها مثيل، والدقة في تجميع نانو النطاق والحجم الصغير مكونات الخلوية دون كارديوميوسيتي. في الآونة الأخيرة، استخدمت هذه البيانات لتوليد نماذج حسابية كارديوميوسيتي أولتراستروكتوري13،14،،من1516. استخدام هذه النماذج طريقة محاكاة هندسة راسخة، تسمى طريقة العناصر المحدودة17، لإنشاء عنصر محدد الشبكات الحاسوبية عبر كارديوميوسيتي والعمليات الكيميائية الحيوية التي يمكن محاكاة تقلصات. ومع ذلك، هذه النماذج محدودة بالقرار والتفاصيل التي يمكن أن توفر أسلوب الفحص المجهري في dataset صورة. على سبيل المثال، يمكن أن تولد الميكروسكوب الإلكتروني نانومتر-مستوى من التفصيل لهيكل الخلية، لكن من الصعب تحديد البروتينات المحددة داخل الصورة التي ستكون ضرورية لإنشاء نموذج. من ناحية أخرى، يمكن أن توفر مجهرية بصرية فائقة القرار الصور عالية التباين في قرارات بناء على أمر من 50 نانومتر فقط تحديد عدد قليل الجزيئية مكونات الخلية. إلا من خلال إدماج معلومات تكميلية من هذه الطرائق التصوير يمكن أحد واقعيا استكشاف حساسية الدالة إلى تغييرات في الهيكل. الارتباطية الضوء والمجهر الإلكتروني لا يزال غير إجراء روتيني، وأنها سوف لا تزال تعاني الحد أن عدد محدود فقط من مكونات يمكن الملون في رأي الفلورة ويرتبط مع الرأي القائل بالميكروسكوب الإلكتروني.
ويقدم هذا البروتوكول نهج رواية18 يستخدم الأساليب الإحصائية19 لتحليل والصمامات حسابياً المعلومات الخفيفة الميكروسكوب في التوزيع المكاني لقنوات أيون بالميكروسكوب الإلكتروني معلومات عن القلب الأخرى مكونات أولتراستروكتوري، مثل ميوفيبريلس والميتوكوندريا. وهذا ينتج نموذج عنصر محدود التي يمكن استخدامها مع النماذج الفيزيائية للعمليات الكيميائية الحيوية لدراسة دور المنظمة كارديوميوسيتي الخلوية الفرعية على العمليات البيوكيميائية التي تنظم انكماش كارديوميوسيتي. على سبيل المثال، يمكن استخدام هذا البروتوكول لإنشاء نماذج من صحية ونماذج myocytes القلب السكري الناجم عن بالستريبتوزوتوسين لدراسة تأثير يعيد البناء الهيكلي في وظيفة القلب الخلية التي يتم ملاحظتها في الحيوان السكري8. ميزة إضافية للطبيعة الإحصائية لطريقة عرض تتجلى أيضا في البروتوكول: الأسلوب يمكن إنشاء مثيلات متعددة من الهندسات العناصر المحدودة التي تحاكي عن كثب التغيرات الملحوظة تجريبيا في هيكل الخلية.
كنظرة عامة، تشمل الخطوات البروتوكول: (ط) إعداد الأنسجة القلبية الميكروسكوب الإلكتروني توليد صور ثلاثية الأبعاد مع القرار كافية والتباين؛ (ثانيا) إعادة الإعمار وتجزئة من مداخن صورة ثلاثية الأبعاد من البيانات الميكروسكوب الإلكتروني باستخدام برنامج تحليل الصور والتعمير الميكروسكوب الإلكتروني 3D دعا إيمود20؛ (ثالثا) باستخدام iso2mesh21 لتوليد شبكة عناصر محددة باستخدام بيانات مجزأة كمدخلات؛ (رابعا) باستخدام خوارزمية جديدة ورموز لخريطة توزيع قنوات أيون على شبكة العناصر المحددة.
الفرضية من النهج المتبع في كل خطوة ويرد ضمن البروتوكول، ويتم توفير نتائج الممثل في الأرقام المصاحبة لها. نظرة عامة حول يرد تحديد كيف يمكن استخدام نماذج مفصلة مكانياً الذي تم إنشاؤه لدراسة ديناميات المكانية من الكالسيوم خلال رعاية الطفولة المبكرة، فضلا عن الاستقلاب المتقدرية. مناقشة لبعض القيود المفروضة حاليا على البروتوكول، فضلا عن التطورات الجديدة التي تجري حاليا للتغلب عليها، والمضي قدما إلى فهم كمي لدور هيكل الخلية لنظم القلب بيولوجيا. ويتناول أيضا كيف يمكن تعميم هذه الأساليب لإنشاء نماذج العناصر المحدودة لأنواع أخرى من الخلايا.
المستخدمين لهذا البروتوكول قد تخطي الخطوة 1 والجزء التعمير من الخطوة 2 إذا كان لديهم الوصول إلى كومة صورة الميكروسكوب الإلكتروني موجودة من قبل. ولعل المستخدمين الذين يعتزمون الحصول على البيانات الخاصة بهم بالتعاون مع ميكروسكوبيستس الإلكترون أكثر خبرة لمناقشة ومقارنة بالتثبيت وإجراءات المصبوغة في الخطوة 1 مع الخبير لتحديد وضع بروتوكول أمثل لاقتناء.
Protocol
Representative Results
Discussion
يحدد البروتوكول أعلاه الخطوات الأساسية لإنشاء نموذج عنصر محدود رواية هندسية من أولتراستروكتوري كارديوميوسيتي. الأسلوب يتيح طرائق الانصهار الحسابية للفحص المجهري مختلفة (أو، من حيث المبدأ، بيانات أخرى) لوضع نموذج حسابية أكثر شمولاً لديناميات كارديوميوسيتي الذي يتضمن تفاصيل عن العمارة ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
كان يدعمها هذا العمل الملكية المجتمع من نيوزيلندا مارسدن سريعة بدء المنحة 11-أوا-184 ومنح “العلم الحدود البشرية برنامج البحوث” RGP0027-2013 والاسترالية البحث اكتشاف المشروع مجلس DP170101358 منحة.
Materials
| Materials | |||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 746398 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| Dextrose | Sigma-Aldrich | D9434 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 25% Glutaraldehyde EM Grade (500 ml bottle) | Merck | 354400-500ML | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Tannic Acid | Sigma-Aldrich | 403040-500G | 100g EM grade |
| Sodium cacodylate | Sigma-Aldrich | C0250 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4593 | |
| Osmium Tetroxide | Sigma-Aldrich | 75632-10ML | 4% in water, 5 ml bottle (or 10 ml bottle also available) |
| Uranyl Acetate | EM Sciences | 22400 | 25g bottle |
| Potassium Ferrocyanide | Merck Millipore | 104973 | |
| Toluene blue | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Borax | Sigma-Aldrich | S9640 | also termed sodium borate |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 792780 | Diluted to different percentages with pure water |
| Acetone | EM Sciences | RT10017 | |
| Resin kit | EM Sciences | 14040 | ACM Durcupan works well |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H9892 | 1Normal solution |
| Equipment | |||
| Ultramicrotome | Leica | EM UC7 | |
| Transmission electron microscope | ThermoFisher Scientific | Tecnai F30 | http://www.leica-microsystems.com/ |
| Retort stand | Proscitech | T752 | |
| Tubing | BioStrategy | 75831-346 | for langendorff perfusion apparatus, 3 mm diameter is recommended but not essential |
| Stopcocks | SDR | QP13813 | for langendorff tubing; product is only an example, user can select any |
| retort stand clamps | Proscitech | T715 | |
| Plastic syringes | SDR | QPC1108 | for solutions on langendorff apparatus |
| Cannulation silk suture, 7-0 | TeleFlex | 15B051000 | for tieing heart on langedorff apparatus |
| Cannula | Made from 3 mm outer-diameter steel needle | ||
| Rubber petri dish mat | Proscitech | H068 | for use as cutting board during fixed-heart dissection |
| Razor blades | Proscitech | L056 | for cutting fixed-heart into small blocks for EM processing |
| Glass bottles | BioStrategy | 89000-236 | for storing solutions during tissue fixation and processing for EM |
| Beakers | BioStrategy | 213-0477 | for storing solutions temporarily and during perfusion |
| Scintillation vials | BioStrategy | 548-2170 | for tissue samples during EM processing |
| Dissection kit | Proscitech | T161 | for animal dissection |
| Syringe Filters | Proscitech | WS3-02225S | for purification of Uranyl Acetate |
| Aluminium/silver foil baking cups | From any baking products store | ||
| Dupont Diamond knife | BioStrategy | 102680-780 | 35 degree angle version produces best sections. |
| Colloidal Gold | BBI Solutions | EM. GC15 | 15 nm colloidal gold |
| EM mesh grids | Proscitech | GCU150 | a variety of sizes can be tested: GCU150h, GCU200h for example |
| Plastic disposal pippettes | Proscitech | LCH20 | best to use plastic disposables especially when working with resin |
| Software | |||
| SerialEM | University of Boulder | tomography acquisition | |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| IMOD | University of Boulder | image alignment and segmentation | |
| iso2mesh | available at http://iso2mesh.sourceforge.net | ||
| Fiji or similar image processing software | ImageJ | Fiji is Just Image J | available at https://fiji.sc for manipulation of binary image stacks |
| RyR-Simulator codes/data | CellSMB group | available at https://github.com/CellSMB/RyR-simulator | |
| CardiacCellMeshGenerator | CellSMB group | comes with RyR-Simulator under folder "gui-version" | |
| R-statistics software | R-project | Download from https://www.r-project.org | |
| spatstat | R-project | install via R program | |
| rgl | R-project | install via R program | |
| doparallel | R-project | install via R program | |
| foreach | R-project | install via R program | |
| doSNOW | R-project | install via R program | |
| iterators | R-project | install via R program |
References
- Noble, D., Rudy, Y. Models of cardiac ventricular action potentials: iterative interaction between experiment and simulation. Phil. Trans. R. Soc. A: Math., Phys. and Eng. Sci. 359 (1783), 1127-1142 (2001).
- Williams, G. S. B., Smith, G. D., Sobie, E. A., Jafri, M. S. Models of cardiac excitation-contraction coupling in ventricular myocytes. Math. Biosci. 226 (1), 1-15 (2010).
- Beard, D. A., Vendelin, M. Systems biology of the mitochondrion. Am. J. Phys. – Cell Phys. 291 (6), C1101-C1103 (2006).
- Crampin, E. J., Smith, N. P. A Dynamic Model of Excitation-Contraction Coupling during Acidosis in Cardiac Ventricular Myocytes. Biophys. J. 90 (9), 3074-3090 (2006).
- Li, L., Louch, W. E., et al. Calcium Dynamics in the Ventricular Myocytes of SERCA2 Knockout Mice: A Modeling Study. Biophys. J. 100 (2), 322-331 (2011).
- Shimizu, I., Minamino, T. Physiological and pathological cardiac hypertrophy. J. Mol. Cell. Cardiol. 97, 245-262 (2016).
- Wei, S., Guo, A., et al. T-tubule remodeling during transition from hypertrophy to heart failure. Circ. Res. 107 (4), 520-531 (2010).
- Jarosz, J., Ghosh, S., et al. Changes in mitochondrial morphology and organization can enhance energy supply from mitochondrial oxidative phosphorylation in diabetic cardiomyopathy. Am. J. Phys. – Cell Phys. 312 (2), C190-C197 (2017).
- González, A., Ravassa, S., Beaumont, J., López, B., Díez, J. New Targets to Treat the Structural Remodeling of the Myocardium. J. Am. Coll. Cardiol. 58 (18), 1833-1843 (2011).
- Hayashi, T., Martone, M. E., Yu, Z., Thor, A., Doi, M. Three-dimensional electron microscopy reveals new details of membrane systems for Ca2+ signaling in the heart. J. Cell Sci. , (2009).
- Soeller, C., Crossman, D., Gilbert, R., Cannell, M. B. Analysis of ryanodine receptor clusters in rat and human cardiac myocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. 104 (38), 14958-14963 (2007).
- Soeller, C., Baddeley, D. Super-resolution imaging of EC coupling protein distribution in the heart. J. Mol. Cell. Cardiol. 58 (1), 32-40 (2013).
- Yu, Z., Holst, M. J., et al. Three-dimensional geometric modeling of membrane-bound organelles in ventricular myocytes: bridging the gap between microscopic imaging and mathematical simulation. J. Struct. Biol. 164 (3), 304-313 (2008).
- Hake, J., Edwards, A. G., et al. Modelling cardiac calcium sparks in a three-dimensional reconstruction of a calcium release unit. J. Physiol. 590 (18), 4403-4422 (2012).
- Soeller, C., Jayasinghe, I. D., Li, P., Holden, A. V., Cannell, M. B. Three-dimensional high-resolution imaging of cardiac proteins to construct models of intracellular Ca2+ signalling in rat ventricular myocytes. Exp. Physiol. 94 (5), 496-508 (2009).
- Kekenes-Huskey, P. M., Cheng, Y., Hake, J. E. Modeling effects of L-type Ca2+ current and Na+-Ca2+ exchanger on Ca2+ trigger flux in rabbit myocytes with realistic t-tubule geometries. Front. in Physiol. 3, 1-14 (2012).
- Zienkiewicz, O. C., Taylor, R. L. . The finite element method. 1, (2000).
- Rajagopal, V., Bass, G., et al. Examination of the effects of heterogeneous organization of RyR clusters, myofibrils and mitochondria on Ca2+ release patterns in cardiomyocytes. PLoS Comp. Biol. 11 (9), e1004417 (2015).
- Illian, J., Penttinen, A., Stoyan, H., Stoyan, D. . Statistical Analysis and Modelling of Spatial Point Patterns. Statistical Analysis and Modelling of Spatial Point Patterns. , 1-534 (2008).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer Visualization of Three-Dimensional Image Data Using IMOD. J. Struct. Biol. 116, 71-76 (1996).
- Fang, Q., Boas, D. A. Tetrahedral mesh generation from volumetric binary and grayscale images. Proc. ISBI. , 1142-1145 (2009).
- Aune, D. J., Herr, S. E., Menick, D. R. Induction and assessment of ischemia-reperfusion injury in langendorff perfused rat hearts. J. Vis. Exp. (101), e52908 (2015).
- Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, culture and transduction of adult mouse cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (114), (2016).
- Hagler, H. K. Ultramicrotomy for biological electron microscopy. Electron Microscopy: Methods and Protocols. 369 (Chapter 5), 67-96 (2007).
- He, W., He, Y. Electron tomography for organelles, cells, and tissues. Electron Microscopy: Methods and Protocols. 1117 (20), 445-483 (2014).
- Diggle, P., Marron, J. S. Equivalence of smoothing parameter selectors in density and intensity estimation. J. Am. Stat. Assoc. 83 (403), 793-800 (1988).
- Ghosh, S., Crampin, E. J., Hanssen, E., Rajagopal, V. A computational study of the role of mitochondrial organization on cardiac bioenergetics. Proc. EMBC. , 2696-2699 (2017).
- Pinali, C., Kitmitto, A. Serial block face scanning electron microscopy for the study of cardiac muscle ultrastructure at nanoscale resolutions. J. Mol. Cell. Cardiol. 76, 1-11 (2014).
- Hussain, A., Hanssen, E., Rajagopal, V. A Semi-Automated Workflow for Segmenting Contents of Single Cardiac Cells from Serial-Block-Face Scanning Electron Microscopy Data. Microsc Microanal. 23 (S1), 240-241 (2017).
- Pinali, C., Bennett, H., Davenport, J. B., Trafford, A. W., Kitmitto, A. Three-dimensional reconstruction of cardiac sarcoplasmic reticulum reveals a continuous network linking transverse-tubules: this organization is perturbed in heart failure. Circ. Res. 113 (11), 1219-1230 (2013).
- LeGrice, I. J., Hunter, P. J., Smaill, B. H. Laminar structure of the heart: a mathematical model. Am. J. Physiol. 272 (5 Pt 2), H2466-H2476 (1997).
- Jayasinghe, I. D., Cannell, M. B., Soeller, C. Organization of ryanodine receptors, transverse tubules, and sodium-calcium exchanger in rat myocytes. Biophys. J. 97 (10), 2664-2673 (2009).
- Jayasinghe, I. D., Crossman, D. J., Soeller, C., Cannell, M. B. Comparison of the organization of t-tubules, sarcoplasmic reticulum and ryanodine receptors in rat and human ventricular myocardium. Clinic. Exp. Pharmacol. P. 39 (5), 469-476 (2012).
- Bradley, C., Bowery, A., et al. OpenCMISS: a multi-physics & multi-scale computational infrastructure for the VPH/Physiome project. Prog. Biophys. Mol. Bio. 107 (1), 32-47 (2011).
