Ce protocole décrit une nouvelle méthode pour créer un modèle par éléments finis spatialement détaillée de l’architecture intracellulaire des cardiomyocytes de microscopie électronique et d’images de microscopie confocale. La puissance de ce modèle dans l’espace détaillé est démontrée à l’aide d’études de cas en signalisation calcique et la bioénergétique.
Avec l’avènement des trois dimensions (3D) technologies d’imagerie telles que la tomographie électronique, serial-îlot balayage, microscopie confocale, microscopie électronique et la communauté scientifique a accès sans précédent aux grands ensembles de données au micromètre sous résolution qui caractérisent le remodelage architectural qui accompagne les changements dans la fonction cardiomyocyte sain ou malade. Cependant, ces ensembles de données ont été sous-utilisées pour enquêter sur le rôle de l’architecture cellulaire se transformant en fonction du cardiomyocyte. Ce protocole vise à décrire comment créer un modèle par éléments finis précis d’un cardiomyocyte à l’aide de la microscopie électronique à haute résolution et des images de microscopie confocale. Un modèle détaillé et précis de l’architecture cellulaire a un potentiel important d’offrir de nouvelles perspectives sur la biologie du cardiomyocyte, plus que peuvent recueillir des expériences seuls. La puissance de cette méthode réside dans sa capacité à fusionner des informations provenant des deux modalités d’imagerie disparates de l’ultrastructure du cardiomyocyte pour développer un modèle unifié et détaillé de la cardiomyocyte. Ce protocole décrit les étapes pour intégrer la tomographie électronique et des images de microscopie confocale de cardiomyocytes mâles adultes de rat Wistar (nom d’une race spécifique de rat albinos) d’élaborer un modèle de moitié-sarcomère par éléments finis de la cardiomyocyte. La procédure génère un modèle éléments finis 3D qui contient une description précise, haute résolution (sur l’ordre de ~ 35 nm) de la distribution des mitochondries, des myofibrilles et des grappes de récepteurs de la ryanodine qui libèrent du calcium nécessaire pour cardiomyocyte contraction du réseau réticulaire sarcoplasmique (SR) dans le myofibrillaire et le compartiment cytosolique. Le modèle généré ici comme une illustration n’intègre pas les détails de l’architecture de tubules transverses ou le réseau réticulaire sarcoplasmique et est donc un modèle minimal de la cardiomyocyte. Néanmoins, le modèle peut déjà s’appliquer dans les enquêtes basées sur des simulations dans le rôle de structure cellulaire en bioénergétique de signalisation et mitochondrial calcium, qui est illustrée et discutées à l’aide de deux études de cas qui se présentent après la Protocole détaillé.
Couplage excitation-contraction (ECC) dans le coeur se réfère à l’important et complexe de couplage entre l’excitation électrique de la membrane du cardiomyocyte et la contraction mécanique ultérieure de la cellule au cours de chaque battement cardiaque. Des modèles mathématiques ont joué un rôle clé dans le développement d’une compréhension quantitative des processus biochimiques liées entre elles qui régulent le potentiel d’action1, calcium cytosolique,2,3de bioénergétique, de signalisation et suivantes génération de la force contractile. Ces modèles ont prédit avec succès les changements de la fréquence cardiaque quand on ou plusieurs de ces processus biochimiques subissent des altérations4,5. L’ultrastructure très organisés de la cardiomyocyte reconnue plus en plus à jouer un rôle essentiel dans la fonction contractile normale de la cellule et le coeur entier. En effet, les modifications de la morphologie et l’Organisation des composantes de l’ultrastructure cardiaque surviennent parallèlement aux changements biochimiques de pathologies telles que l’hypertrophie6, insuffisance cardiaque7et8de la cardiomyopathie diabétique. Si ces changements structurels sont mineures, adaptatives ou pathologiques des réponses à l’évolution des conditions biochimiques est encore largement inconnue9. L’accouplement intrinsèquement étroit entre forme et fonction en biologie signifie que des études expérimentales ne peuvent fournir des idées plus profondes que les corrélations entre remodelage structural et fonction cardiomyocyte. Une nouvelle génération de modèles mathématiques qui peuvent incorporer l’ensemble structurel des composants subcellulaires, ainsi que les processus biochimiques bien étudiés, sont nécessaires pour développer une compréhension globale et quantitative de la relation entre la structure, la biochimie et la force contractile dans les cardiomyocytes. Ce protocole décrit les méthodes qui peuvent être utilisées pour produire des modèles d’éléments finis structurellement précis des cardiomyocytes qui peut être utilisés pour de telles enquêtes.
La dernière décennie a connu des avancées significatives en microscopie 3D10, confocale11et Super-résolution microscopie12 qui donnent un aperçu sans précédent, à haute résolution de l’Assemblée-l’échelle du nanomètre et micro-échelle de la composants subcellulaires du cardiomyocyte. Récemment, ces ensembles de données ont été utilisés pour générer des modèles de calcul du cardiomyocyte ultrastructure13,14,15,16. Ces modèles utilisent une méthode de simulation technique bien établie, appelée la méthode des éléments finis17, pour créer des éléments finis computational mailles sur lequel les processus biochimiques et les cardiomyocytes des contractions peuvent être simulées. Cependant, ces modèles sont limités par la résolution et les détails qu’une méthode de microscopie peut fournir dans un ensemble de données image. Par exemple, la microscopie électronique peut générer nanomètre-niveau de détail de la structure cellulaire, mais il est difficile d’identifier des protéines spécifiques au sein de l’image qui serait nécessaire pour créer un modèle. En revanche, la microscopie optique Super-résolution peut fournir des images à fort contraste avec des résolutions sur l’ordre de 50 nm de seulement un choisir quelques moléculaire les composants de la cellule. Seulement en intégrant des informations complémentaires de ces modalités d’imagerie peut on Explorer avec réalisme la sensibilité de la fonction de changements dans la structure. Microscopie corrélative photonique et électronique n’est toujours pas une procédure de routine et il souffrirait toujours la limitation que seulement un nombre limité de composants puisse être teinté dans la vue de l’immunofluorescence et en corrélation avec la vue au microscope électronique.
Ce protocole présente une nouvelle approche de18 qui utilise des méthodes statistiques19 pour analyser et par le calcul fusible microscopie photonique informations sur la distribution spatiale des canaux ioniques avec des microscopes sur autre cardiaque composants de l’ultrastructure, tels que les mitochondries et les myofibrilles. Ceci produit un modèle éléments finis qui peut être utilisé avec les modèles biophysiques des processus biochimiques d’étudier le rôle d’organisation subcellulaire cardiomyocyte sur les processus biochimiques qui régulent la contraction cardiomyocyte. Par exemple, ce protocole pourrait être utilisé pour créer des modèles de bonne santé et les myocytes cardiaques diabétique par streptozotocine pour étudier les effets du remodelage structural sur la fonction des cellules cardiaques qui est observée chez l’animal diabétique modèles8. Un autre avantage de la nature statistique de la méthode présentée est également illustré dans le protocole : la méthode peut générer plusieurs instances des géométries d’éléments finis qui imitent les variations observées expérimentalement dans la structure cellulaire.
Comme un aperçu, les étapes du protocole comprennent : (i) préparation du tissu cardiaque pour la microscopie électronique générer des images 3D avec suffisamment de résolution et de contraste ; (ii) la reconstruction et la segmentation des piles 3D image de microscopie électronique de données à l’aide d’une reconstruction 3D de la microscopie et analyse d’images logiciel appelé IMOD20; (iii) l’utilisation d’iso2mesh21 pour générer un maillage éléments finis en utilisant les données segmentées comme entrée ; (iv) en utilisant les codes et un nouvel algorithme pour cartographier la distribution des canaux ioniques sur le maillage éléments finis.
Le principe de l’approche de chaque étape est décrite dans le protocole, et les résultats représentatifs sont fournis dans les figures qui l’accompagne. Une vue d’ensemble est exposé précisant comment les modèles spatialement détaillés générés peuvent servir à étudier les dynamiques spatiales de calcium durant ECC, ainsi que bioénergétique mitochondriale. Certaines des limites actuelles du protocole sont discutés, ainsi que les nouveautés qui sont en cours pour y remédier et de favoriser une compréhension quantitative du rôle de la structure cellulaire de biologie des systèmes cardiaque. Comment ces méthodes puissent être généralisés pour créer des modèles d’éléments finis d’autres types de cellules sont également abordé.
Les utilisateurs du présent protocole peuvent ignorer étape 1 et la partie de la reconstruction de l’étape 2 s’ils ont accès à une pile d’image au microscope électronique préexistants. Les utilisateurs qui ont l’intention d’acquérir leurs données en collaboration avec les plus expérimentés électrons microscopistes voudra discuter et comparer la fixation et les méthodes de coloration à l’étape 1 avec l’expert afin de déterminer un protocole optimal pour l’acquisition.
Le protocole ci-dessus donne un aperçu des étapes clés pour générer un modèle géométrique de nouveaux éléments finis de l’ultrastructure du cardiomyocyte. La méthode permet aux modalités de calcul de fusion des différents microscopes (ni, en principe, autres données) à développer un modèle de calcul plus complète du cardiomyocyte dynamique qui inclut des détails de l’architecture cellulaire spatiale. Il n’y a actuellement aucun autre protocole disponible pour créer un tel modèle d’un cardiomy…
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par la Royal Society de New Zealand Marsden vite commencer Grant 11-LABNT-184, la subvention de recherche de programme de Science frontières humaines RGP0027/2013 et l’australien recherche Conseil découverte projet Grant DP170101358.
Materials | |||
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 746398 | |
Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C8106 | |
Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2393 | |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | |
Dextrose | Sigma-Aldrich | D9434 | |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | |
2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | B0753 | |
25% Glutaraldehyde EM Grade (500 ml bottle) | Merck | 354400-500ML | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
Tannic Acid | Sigma-Aldrich | 403040-500G | 100g EM grade |
Sodium cacodylate | Sigma-Aldrich | C0250 | |
Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4593 | |
Osmium Tetroxide | Sigma-Aldrich | 75632-10ML | 4% in water, 5 ml bottle (or 10 ml bottle also available) |
Uranyl Acetate | EM Sciences | 22400 | 25g bottle |
Potassium Ferrocyanide | Merck Millipore | 104973 | |
Toluene blue | Sigma-Aldrich | T3260 | |
Borax | Sigma-Aldrich | S9640 | also termed sodium borate |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 792780 | Diluted to different percentages with pure water |
Acetone | EM Sciences | RT10017 | |
Resin kit | EM Sciences | 14040 | ACM Durcupan works well |
Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H9892 | 1Normal solution |
Equipment | |||
Ultramicrotome | Leica | EM UC7 | |
Transmission electron microscope | ThermoFisher Scientific | Tecnai F30 | http://www.leica-microsystems.com/ |
Retort stand | Proscitech | T752 | |
Tubing | BioStrategy | 75831-346 | for langendorff perfusion apparatus, 3 mm diameter is recommended but not essential |
Stopcocks | SDR | QP13813 | for langendorff tubing; product is only an example, user can select any |
retort stand clamps | Proscitech | T715 | |
Plastic syringes | SDR | QPC1108 | for solutions on langendorff apparatus |
Cannulation silk suture, 7-0 | TeleFlex | 15B051000 | for tieing heart on langedorff apparatus |
Cannula | Made from 3 mm outer-diameter steel needle | ||
Rubber petri dish mat | Proscitech | H068 | for use as cutting board during fixed-heart dissection |
Razor blades | Proscitech | L056 | for cutting fixed-heart into small blocks for EM processing |
Glass bottles | BioStrategy | 89000-236 | for storing solutions during tissue fixation and processing for EM |
Beakers | BioStrategy | 213-0477 | for storing solutions temporarily and during perfusion |
Scintillation vials | BioStrategy | 548-2170 | for tissue samples during EM processing |
Dissection kit | Proscitech | T161 | for animal dissection |
Syringe Filters | Proscitech | WS3-02225S | for purification of Uranyl Acetate |
Aluminium/silver foil baking cups | From any baking products store | ||
Dupont Diamond knife | BioStrategy | 102680-780 | 35 degree angle version produces best sections. |
Colloidal Gold | BBI Solutions | EM. GC15 | 15 nm colloidal gold |
EM mesh grids | Proscitech | GCU150 | a variety of sizes can be tested: GCU150h, GCU200h for example |
Plastic disposal pippettes | Proscitech | LCH20 | best to use plastic disposables especially when working with resin |
Software | |||
SerialEM | University of Boulder | tomography acquisition | |
MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
IMOD | University of Boulder | image alignment and segmentation | |
iso2mesh | available at http://iso2mesh.sourceforge.net | ||
Fiji or similar image processing software | ImageJ | Fiji is Just Image J | available at https://fiji.sc for manipulation of binary image stacks |
RyR-Simulator codes/data | CellSMB group | available at https://github.com/CellSMB/RyR-simulator | |
CardiacCellMeshGenerator | CellSMB group | comes with RyR-Simulator under folder "gui-version" | |
R-statistics software | R-project | Download from https://www.r-project.org | |
spatstat | R-project | install via R program | |
rgl | R-project | install via R program | |
doparallel | R-project | install via R program | |
foreach | R-project | install via R program | |
doSNOW | R-project | install via R program | |
iterators | R-project | install via R program |